Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica

Resumo

Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .

Resumo

Tradicionalmente usados para ensaios bioquímicos a granel, os extratos de ovos de Xenopus laevis surgiram como uma poderosa ferramenta baseada em imagens para estudar fenômenos citoplasmáticos, como citocinese, formação de fuso mitótico e montagem do núcleo. Com base nos primeiros métodos que visualizavam extratos fixos amostrados em pontos de tempo esparsos, abordagens recentes de extratos ao vivo de imagem usando microscopia de lapso de tempo, revelando características mais dinâmicas com resolução temporal aprimorada. Esses métodos geralmente requerem tratamentos de superfície sofisticados do vaso de imagem. Aqui apresentamos um método alternativo para imagens vivas de extratos de ovos que não requerem tratamento químico de superfície. É simples de implementar e utiliza consumíveis de laboratório produzidos em massa para imagens. Descrevemos um sistema que pode ser usado tanto para microscopia de campo amplo quanto para microscopia confocal. Ele é projetado para extratos de imagem em um campo 2-dimensional (2D), mas pode ser facilmente estendido para imagens em 3D. É bem adequado para estudar a formação de padrões espaciais dentro do citoplasma. Com dados representativos, demonstramos a organização dinâmica típica de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em extratos interfásicos preparados usando este método. Esses dados de imagem podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica citoplasmática e a organização espacial.

Introdução

O citoplasma constitui o volume principal de uma célula e tem uma organização distinta. Os ingredientes do citoplasma eucariótico podem se auto-montar em uma ampla gama de estruturas espaciais, como as ásteres de microtúbulos e o aparelho de Golgi, que por sua vez são dinamicamente dispostos e transformados dependendo da identidade da célula e do estado fisiológico. Compreender a organização espacial do citoplasma e sua ligação com as funções celulares é, portanto, importante para entender como a célula funciona. Os extratos de ovos de Xenopus laevis têm sido tradicionalmente utilizados para ensaios bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, mas trabalhos recentes os estabelecem como um poderoso sistema de imagem viva para estudos mecanicistas de estruturas citoplasmáticas e suas funções celulares 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Esses extratos não diluídos preservam muitas estruturas e funções do citoplasma, ao mesmo tempo em que permitem manipulações diretas de conteúdo citoplasmático não alcançáveis em modelos convencionais baseados em células^19,20. Isso os torna ideais para caracterizar fenômenos citoplasmáticos e dissecar seus fundamentos mecanicistas.

Os métodos existentes para extratos de imagem requerem modificações químicas de superfície ou fabricação de dispositivos microfluídicos. Um método baseado em deslizamento de cobertura requer a passivação de polietilenoglicol (PEG) de coberturas de vidro²¹. Um método baseado em microemulsão requer a deposição de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano em superfícies de vidro^22,23. Os sistemas de base microfluídica permitem o controle preciso do volume, geometria e composição das gotículas de extrato, mas requerem instalações especializadas de microfabricação ^11,12,24.

Aqui apresentamos um método alternativo para a imagem de extratos de ovos que é fácil de implementar e utiliza materiais prontamente disponíveis e de baixo custo. Isso inclui a preparação de uma câmara de imagem com uma lâmina e uma folha de cobertura revestida com fita fluorada de etileno propileno (FEP). A câmara pode ser usada para extratos de imagem com uma variedade de sistemas de microscopia, incluindo estereoscópios e microscópios verticais e invertidos. Este método não requer tratamento químico de superfícies, ao mesmo tempo em que alcança clareza óptica semelhante obtida com os métodos existentes à base de vidro discutidos acima. Ele é projetado para criar imagens de uma camada de extratos com uma espessura uniforme em um campo 2D e pode ser facilmente estendido para visualizar um volume 3D de extratos. É bem adequado para imagens de lapso de tempo do comportamento citoplasmático coletivo em um grande campo de visão.

Usamos extratos de ovos presos entre fases para demonstrar nosso método de imagem. A preparação do extrato segue o protocolo de Deming e Kornbluth¹⁹. Resumidamente, os ovos naturalmente presos na metáfase da meiose II são esmagados por um giro de baixa velocidade. Este spin libera o citoplasma da parada meiótica e permite que o extrato prossiga para a interfase. Normalmente, a citocalasina B é adicionada antes do spin de esmagamento para inibir a formação de F-actina. No entanto, pode ser omitido se a F-actina for desejada. A cicloheximida também é adicionada antes do spin de esmagamento para evitar que o extrato interfásico entre na próxima mitose. Os extratos são posteriormente colocados nas câmaras de imagem acima mencionadas e colocados em um microscópio. Finalmente, as imagens são gravadas ao longo do tempo em intervalos definidos por uma câmera conectada ao microscópio, produzindo séries de imagens de lapso de tempo que capturam o comportamento dinâmico da extração em um campo 2D.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.

1. Preparação de lâminas e folhas de cobertura

1. Aplique uma camada de fita adesiva de etileno propileno fluorado (FEP) em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Prepare as coberturas revestidas com fita FEP da mesma forma (Figura 1A).
2. Aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP do slide. Deixe o forro protetor na parte superior descascado (Figura 1A).
   NOTA: As lâminas e as folhas de cobertura devem ser preparadas antes da experiência. Eles podem ser usados imediatamente ou armazenados em caixas para evitar o acúmulo de poeira nas superfícies. O poço no espaçador de imagem tem 120 μm de profundidade e um diâmetro de 9 mm.

2. Preparação e imagem ao vivo de extratos de ovos presos entre fases

NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de Deming e Kornbluth¹⁹, Murray²⁰ e Smythe e Newport²⁵ com modificações. Todas as etapas devem ser executadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Três a dez dias antes da coleta de ovos, injete rãs Xenopus laevis maduras por via subcutânea no saco linfático dorsal com 100 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG).
2. Dezesseis a dezoito horas antes da coleta planejada de ovos, injete as rãs da etapa 2.1 com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Deixar as rãs a 18 °C em tampão de postura de ovos (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2,5 mM CaCl 2·_2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, preparar como solução-mãe 20x a pH _7,4 e diluir com água limpa do tanque de rãs a 1x antes da utilização) até à recolha dos ovos.
3. No dia do experimento, colete ovos em uma grande placa de Petri de vidro e avalie a qualidade dos ovos. Descarte todos os ovos que se pareçam com bolas brancas inchadas ou que apareçam em uma corda (Figura 1B). Examine os ovos sob um estereoscópio, mantenha os ovos com aparência normal (Figura 1C) e descarte aqueles com pigmento irregular ou manchado (Figura 1D).
   NOTA: Este protocolo funciona com ovos coletados de uma única rã, que normalmente põe 25 mL de ovos em 16 horas após a injeção de hCG. Normalmente, um total de 3 a 6 rãs são induzidas por hCG, e a rã com a mais alta qualidade de ovos é escolhida para o experimento de preparação do extrato.
4. Transfira os ovos para um copo de vidro de 400 mL e remova o máximo de tampão de postura de ovos possível por decantação.
5. Incubar os ovos em 100 ml de solução desanimadora preparada na hora (L-cisteína a 2% p/v em água, ajustar para pH 8,0 com NaOH) e agitá-los suavemente periodicamente. Após cerca de 3 minutos, despeje a solução e adicione 100 mL de solução fresca de dejelling. Continue a incubação até que os ovos estejam bem embalados (sem espaço entre os ovos), mas evite deixar os ovos na solução desanimadora por mais de um total de 5 minutos.
6. Remover o máximo possível da solução desanimadora por decantação e lavar os ovos em tampão MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparado como uma solução-mãe 10x, ajustado ao pH 7,8 com NaOH e diluído em água Milli-Q antes do uso) adicionando o tampão, girando os ovos e, em seguida, despejando o tampão. Repita algumas vezes até que um total de 1 L do tampão seja usado para as lavagens.
7. Lave os ovos algumas vezes com um total de 400 mL de tampão de lise do ovo (250 mM de sacarose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, feito fresco e ajustado ao pH 7,7 com KOH). Remova os ovos com aparência anormal usando uma pipeta Pasteur entre as lavagens.
   NOTA: Ovos com aparência anormal referem-se àqueles que se parecem com bolas brancas inchadas (Figura 1B), têm pigmentação manchada (Figura 1D), estão se deteriorando com uma região branca crescente (Figura 1E) ou mostram área pigmentada escurecida e contraída no hemisfério animal (Figura 1F).
8. Usando uma pipeta de transferência com a ponta bem aberta, transfira os ovos para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 17 mL contendo 1 mL de tampão de lise de ovos. Gire o tubo em uma centrífuga clínica a 400 x g por 15 segundos para embalar os ovos.
9. Remova o máximo possível do tampão de lise do ovo do topo dos ovos embalados usando uma pipeta Pasteur.
   NOTA: É importante remover o máximo de tampão possível dos ovos embalados, a fim de minimizar a diluição do extrato de ovo. Às vezes, é necessário remover alguns ovos soltos junto com o tampão residual para conseguir isso.
10. Determine o volume aproximado dos ovos embalados e, em seguida, adicione 5 μg/mL de aprotinina, 5 μg/mL de leupeptina, 5 μg/mL de citocalasina B e 50 μg/mL de cicloheximida diretamente sobre os ovos embalados.
    NOTA: A aprotinina e a leupeptina são inibidores da protease. A citocalasina B inibe a polimerização da actina, impedindo a contração e gelificação do extrato²⁶. A cicloheximida inibe a síntese de proteínas, mantendo assim o extrato na interfase do ciclo celular.
11. Esmagar os ovos centrifugando o tubo a 12.000 x g, 4 °C, durante 15 minutos, num rotor de balde oscilante.
    NOTA: Ao final da centrifugação, os ovos devem ter se rompido e o lisado separado em três camadas principais: uma camada lipídica amarela no topo, o extrato citoplasmático (também chamado de extrato bruto) no meio e uma camada densa escura contendo os grânulos de pigmento na parte inferior (Figura 1G).
12. Ligue uma agulha de calibre 18 a uma seringa. Com o bisel da ponta da agulha voltado para cima, perfure o tubo do lado na parte inferior da camada citoplasmática e recupere o extrato desenhando lentamente.
    NOTA: Desenhe o extrato citoplasmático lentamente para evitar a inclusão de conteúdo contaminante da camada lipídica amarela.
13. Transfira o extrato citoplasmático recuperado para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha-o no gelo. Use o extrato dentro de 1 hora.
14. Quando estiver pronto para a imagem, complemente o extrato com os reagentes desejados e sondas de imagem de fluorescência.
    NOTA: As sondas de imagem de fluorescência rotulam estruturas citoplasmáticas específicas para que possam ser visualizadas por um microscópio de fluorescência.
15. Remova o revestimento protetor superior do espaçador de imagem na lâmina preparada na etapa 1.2 e deposite aproximadamente 7 μL de extrato no centro do poço. Aplique imediatamente a tampa revestida com fita FEP com o lado FEP voltado para o extrato para selar o poço. Prossiga rapidamente para a geração de imagens (Figura 1H,I).
16. Coloque a lâmina em um microscópio invertido ou vertical com um palco motorizado e uma câmera digital. Fotografe os extratos nas posições espaciais desejadas e nos intervalos de tempo em canais de campo brilhante e fluorescência.
    Observação : normalmente, um objetivo de 5x é usado para geração de imagens. O estágio motorizado permite a aquisição automatizada de imagens em várias posições espaciais definidas. A microscopia de campo brilhante visualiza estruturas citoplasmáticas com diferentes graus de transparência. A microscopia de fluorescência visualiza as estruturas citoplasmáticas especificamente marcadas pelas sondas de imagem de fluorescência adicionadas na etapa 2.14. A câmera registra imagens de lapso de tempo dessas estruturas, capturando assim a dinâmica da organização citoplasmática.

Resultados

Extratos de ovos de Xenopus laevis podem ser usados para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase. A Figura 2A mostra os resultados de um experimento bem-sucedido. Suplementamos extratos interfaseados com núcleos de espermatozoides desembranados de Xenopus laevis 19 na concentração de 27 núcleos/μL e 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS ^27,28,29,30 (proteína d...

Discussão

Os extratos de ovos de Xenopus laevis emergiram como um poderoso sistema modelo para estudos baseados em imagens de várias estruturas subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organização citoplasmática em um todo

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M