קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

Summary

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

Abstract

תמציות הביצים של Xenopus laevis , המשמשות באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת, התגלו ככלי רב עוצמה המבוסס על הדמיה לחקר תופעות ציטופלסמיות, כגון ציטוקינזיס, היווצרות צירים מיטוטיים והרכבת הגרעין. בהתבסס על שיטות מוקדמות שדיימו תמציות קבועות שנדגמו בנקודות זמן דלילות, גישות אחרונות לתמציות חיות של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן, וחושפות תכונות דינמיות יותר עם רזולוציה טמפורלית משופרת. שיטות אלה דורשות בדרך כלל טיפולי שטח מתוחכמים של כלי ההדמיה. כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיה חיה של תמציות ביצים שאינן דורשות טיפול כימי בפני השטח. הוא פשוט ליישום ומשתמש בחומרים מתכלים מעבדתיים בייצור המוני להדמיה. אנו מתארים מערכת שיכולה לשמש הן למיקרוסקופיה רחבת שדה והן למיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא מיועד להדמיית תמציות בשדה דו-ממדי (דו-ממדי), אך ניתן להרחיבו בקלות להדמיה בתלת-ממד. הוא מתאים היטב לחקר היווצרות תבניות מרחביות בתוך הציטופלסמה. בעזרת נתונים מייצגים, אנו מדגימים את הארגון הדינמי הטיפוסי של מיקרוטובולים, גרעינים ומיטוכונדריה בתמציות אינטרפאזה שהוכנו בשיטה זו. נתוני תמונה אלה יכולים לספק מידע כמותי על דינמיקה ציטופלסמית וארגון מרחבי.

Introduction

הציטופלסמה מהווה את הנפח העיקרי של התא ויש לה ארגון מובחן. המרכיבים של הציטופלסמה האאוקריוטית יכולים להרכיב את עצמם למגוון רחב של מבנים מרחביים, כגון אסטרים מיקרוטובולים ומנגנון גולג'י, אשר בתורם מסודרים באופן דינמי ומתהפכים בהתאם לזהות התא ולמצבו הפיזיולוגי. הבנת הארגון המרחבי של הציטופלסמה והקשר שלה לתפקודים תאיים חשובה אפוא להבנת אופן הפעולה של התא. תמציות ביצים של Xenopus laevis שימשו באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת 1,2,3,4,5,6,7,8, אך עבודה אחרונה מבססת אותן כמערכת הדמיה חיה רבת עוצמה למחקרים מכניסטיים של מבנים ציטופלסמיים ותפקודם התאי 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. תמציות לא מדוללות אלה משמרות מבנים ותפקודים רבים של הציטופלסמה, תוך שהן מאפשרות מניפולציות ישירות של תוכן ציטופלסמי שאינו ניתן להשגה במודלים קונבנציונליים מבוססי תאים^19,20. זה הופך אותם לאידיאליים לאפיון תופעות ציטופלסמיות ולניתוח היסודות המכניסטיים שלהם.

שיטות קיימות להדמיה של תמציות דורשות שינויים כימיים בפני השטח, או ייצור של התקנים מיקרופלואידיים. שיטה אחת המבוססת על כיסוי דורשת פסיבציה של פוליאתילן גליקול (PEG) של כיסויי זכוכית²¹. שיטה מבוססת מיקרו-אמולסיה דורשת תצהיר אדים של טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן על משטחי זכוכית^22,23. מערכות מבוססות מיקרופלואידיקה מאפשרות שליטה מדויקת בנפח, בגיאומטריה ובהרכב של טיפות החילוץ, אך דורשות מתקני מיקרו-פבריקציה מיוחדים^11,12,24.

כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיית תמציות ביצים קלה ליישום ומשתמשת בחומרים זמינים ובעלות נמוכה. זה כולל הכנת תא הדמיה עם שקופית וכיסוי מצופה בסרט אתילן פרופילן פלואוריד (FEP). התא יכול לשמש להדמיית תמציות עם מגוון מערכות מיקרוסקופיה, כולל סטריאוסקופים ומיקרוסקופים זקופים והפוכים. שיטה זו אינה דורשת טיפול כימי במשטחים תוך השגת בהירות אופטית דומה המתקבלת בשיטות קיימות מבוססות זכוכית שנדונו לעיל. הוא נועד לדמות שכבה של תמציות בעובי אחיד על פני שדה דו-ממדי, וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לדמות נפח תלת-ממדי של תמציות. הוא מתאים היטב להדמיה בהילוך מהיר של התנהגות ציטופלסמית קולקטיבית על פני שדה ראייה גדול.

השתמשנו בתמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה כדי להדגים את שיטת ההדמיה שלנו. הכנת התמצית עוקבת אחר הפרוטוקול של דמינג וקורנבלות'¹⁹. בקצרה, ביצים שנעצרו באופן טבעי במטאפאזה של מיוזה II נמעכות על ידי ספין במהירות נמוכה. ספין זה משחרר את הציטופלסמה ממעצר מיוטי ומאפשר לתמצית להמשיך לאינטרפאזה. בדרך כלל, ציטוכלזין B מתווסף לפני ספין הריסוק כדי לעכב היווצרות F-אקטין. עם זאת, ניתן להשמיט אותו אם רוצים F-actin. ציקלוהקסימיד מתווסף גם לפני ספין הריסוק כדי למנוע מתמצית האינטרפאזה להיכנס למיטוזה הבאה. התמציות ממוקמות לאחר מכן בתאי ההדמיה הנ"ל ומונחות על מיקרוסקופ. לבסוף, תמונות מתועדות לאורך זמן במרווחי זמן מוגדרים על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ, ומייצרות סדרות תמונות בהילוך מהיר הלוכדות את ההתנהגות הדינמית של התמצית בשדה דו-ממדי.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת סטנפורד.

1. הכנת שקופיות וכיסויים

1. החל שכבה של סרט דבק אתילן פרופילן פלואוריד (FEP) על מגלשת זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. הכינו כיסויים מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן (איור 1A).
2. החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בסרט FEP של השקופית. השאירו את תוחם המגן בחלק העליון ללא כיסוי (איור 1A).
   הערה: יש להכין את השקופיות והכיסויים לפני הניסוי. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן אותם בקופסאות כדי למנוע הצטברות אבק על משטחים. עומק הבאר במרווח ההדמיה הוא 120 מיקרומטר וקוטרה 9 מ"מ.

2. הכנה והדמיה חיה של תמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה

הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מדמינג וקורנבלות'¹⁹, מאריי²⁰, סמיית' וניופורט²⁵ עם שינויים. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין אחרת.

1. שלושה עד עשרה ימים לפני איסוף הביצים, יש להזריק נקבות בוגרות של צפרדעי Xenopus laevis באופן תת-עורי לתוך שק הלימפה הגבי עם 100 יחב"ל של גונדוטרופין בסוסה הרה (PMSG).
2. שש עשרה עד שמונה עשרה שעות לפני איסוף הביצים המתוכנן, הזריקו לצפרדעים משלב 2.1 500 יחב"ל של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). השאירו צפרדעים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במאגר הטלת ביצים (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H₂ O, 0.5 mMHEPES, 0.1 mM EDTA, הכינו כפתרון מלאי 20x ב- pH_7.4 ודללו עם מי מיכל צפרדע נקיים עד פי 1 לפני השימוש) עד לאיסוף הביצים.
3. ביום הניסוי, אספו ביצים בצלחת פטרי זכוכית גדולה ובדקו את איכות הביצים. השליכו את כל הביצים שנראות כמו כדורים לבנים נפוחים או מופיעות בחוט (איור 1B). בחנו את הביצים תחת סטריאוסקופ, שמרו על הביצים בעלות מראה תקין (איור 1C), והשליכו אותן עם פיגמנט לא סדיר או מנומר (איור 1D).
   הערה: פרוטוקול זה עובד עם ביצים שנאספו מצפרדע בודדת, אשר בדרך כלל מטילה 25 מ"ל של ביצים על ידי 16 שעות לאחר הזרקת hCG. בדרך כלל, סך של 3 עד 6 צפרדעים מושרות על ידי hCG, ואת הצפרדע עם איכות הביצים הגבוהה ביותר נבחר לניסוי הכנת תמצית.
4. מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מ"ל, ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי פירוק.
5. לדגום את הביצים ב-100 מ"ל של תמיסת דג'ל טרייה (2% עם L-ציסטאין במים, להסתגל ל-pH 8.0 עם NaOH) ולסובב אותן בעדינות מעת לעת. לאחר כ-3 דקות, יוצקים את התמיסה, ומוסיפים 100 מ"ל של תמיסת דג'לי טרייה. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב (אין רווח בין הביצים), אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מ-5 דקות בסך הכל.
6. הסר כמה שיותר מתמיסת ההרגעה על ידי פירוק, ושטוף את הביצים בחיץ MMR 0.25x (25 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 0.25 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl₂, 0.025 mM EDTA, 1.25 mM HEPES, מוכן כתמיסת מלאי 10x, מותאם ל- pH 7.8 עם NaOH, ומדולל במי Milli-Q לפני השימוש) על ידי הוספת המאגר, מערבלים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד לשימוש כולל של 1 ליטר מהמאגר לשטיפה.
7. שטפו את הביצים מספר פעמים עם סך של 400 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים (250 מ"מ סוכרוז, 10 מ"ל HEPES, 50 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl₂, 1 mM DTT, עשוי טרי ומותאם ל- pH 7.7 עם KOH). הסר ביצים עם מראה חריג באמצעות פיפטה פסטר בין השטיפות.
   הערה: ביצים עם מראה לא תקין מתייחסות לאלה שנראות כמו כדורים נפוחים לבנים (איור 1B), שיש להן פיגמנטציה מנומרת (איור 1D), מתדרדרות עם אזור לבן שגדל (איור 1E), או מראות אזור פיגמנטי כהה ומכווץ בחצי הכדור של בעלי החיים (איור 1F).
8. באמצעות פיפטה העברה עם קצה פתוח לרווחה, מעבירים את הביצים לצינור צנטריפוגה עגול-תחתון 17 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חיץ ליזיס ביצים. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית בגודל 400 x גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים.
9. הסירו כמה שיותר ממאגר התסיסה של הביצים מהחלק העליון של ביצים ארוזות בעזרת פיפטה של פסטר.
   הערה: חשוב להסיר כמה שיותר חיץ מהביצים הארוזות, על מנת למזער את דילול תמצית הביצית. לפעמים יש צורך להסיר כמה ביצים רופפות יחד עם החיץ השיורי כדי להשיג זאת.
10. קבעו את הנפח המשוער של הביצים הארוזות, ולאחר מכן הוסיפו 5 מיקרוגרם/מ"ל אפרוטינין, 5 מיקרוגרם/מ"ל לאופטין, 5 מיקרוגרם/מ"ל ציטוכלזין B ו-50 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסימיד ישירות על גבי הביצים הארוזה.
    הערה: אפרוטינין ולאופפטין הם מעכבי פרוטאז. ציטוכלזין B מעכב פולימריזציה של אקטין, ומונע מהתמצית להתכווץ ולג'ל²⁶. ציקלוהקסימיד מעכב סינתזת חלבונים, ובכך שומר על התמצית באינטרפאזה של מחזור התא.
11. מרסקים את הביצים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב 12,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, במשך 15 דקות, ברוטור דלי מתנדנד.
    הערה: בסוף הצנטריפוגה, הביצים היו צריכות להיקרע והליזאט הופרד לשלוש שכבות עיקריות: שכבת שומנים צהובה למעלה, תמצית ציטופלסמית (הנקראת גם תמצית גולמית) באמצע, ושכבה צפופה כהה המכילה את גרגירי הפיגמנט בתחתית (איור 1G).
12. חברו מחט באורך 18 מ"מ למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה, לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית, ולשחזר את התמצית על ידי ציור לאט.
    הערה: יש לשאוב את התמצית הציטופלסמית באיטיות כדי למנוע הכללה של תוכן מזהם משכבת השומנים הצהובה.
13. העבירו את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש והחזיקו אותה על קרח. השתמש בתמצית תוך שעה.
14. כשאתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות.
    הערה: בדיקות הדמיה פלואורסצנטיות מסמנות מבנים ציטופלסמיים ספציפיים כך שניתן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
15. הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה בשקופית שהוכנה בשלב 1.2, והפקיד כ -7 μL של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק של FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר. המשיכו במהירות להדמיה (איור 1H,I).
16. הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלציות במיקומים המרחביים ובמרווחי הזמן הרצויים, הן בערוצי השדה הבהיר והן בערוצים הפלואורסצנטיים.
    הערה: בדרך כלל, מטרה פי 5 משמשת להדמיה. השלב הממונע מאפשר קליטת תמונה אוטומטית במספר מיקומים מרחביים מוגדרים. מיקרוסקופיית שדה בהיר מדמיינת מבנים ציטופלסמיים עם דרגות שונות של שקיפות. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ממחישה את המבנים הציטופלסמיים שסומנו במיוחד על ידי בדיקות ההדמיה הפלואורסצנטיות שנוספו בשלב 2.14. המצלמה מתעדת תמונות בהילוך מהיר של מבנים אלה, ובכך לוכדת את הדינמיקה של הארגון הציטופלסמי.

תוצאות

ניתן להשתמש בתמציות ביצים של Xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך interphase. איור 2A מראה תוצאות מניסוי מוצלח. הוספנו תמציות אינטרפאזה עם גרעיני זרע 19 שעברו דה-ממברן של Xenopus laevis בריכוז של 27 גרעינים/μL ו-GST-GFP-NLS מטוהרים בנפח של 0.38 מיקרומ?...

Discussion

תמציות הביצים של Xenopus laevis התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקרים מבוססי הדמיה של מבנים תת-תאיים שונים 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 וארגון ציטופלסמי בכללותו

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M