Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique

Résumé

Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .

Résumé

Traditionnellement utilisés pour les essais biochimiques en vrac, les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont devenus un puissant outil basé sur l’imagerie pour étudier les phénomènes cytoplasmiques, tels que la cytokinèse, la formation de fuseau mitotique et l’assemblage du noyau. S’appuyant sur les premières méthodes qui ont imagé des extraits fixes échantillonnés à des points temporels clairsemés, les approches récentes imagent des extraits vivants en utilisant la microscopie accélérée, révélant des caractéristiques plus dynamiques avec une résolution temporelle améliorée. Ces méthodes nécessitent généralement des traitements de surface sophistiqués du vaisseau d’imagerie. Nous présentons ici une méthode alternative pour l’imagerie en direct d’extraits d’œufs qui ne nécessitent aucun traitement de surface chimique. Il est simple à mettre en œuvre et utilise des consommables de laboratoire produits en série pour l’imagerie. Nous décrivons un système qui peut être utilisé à la fois pour la microscopie à grand champ et la microscopie confocale. Il est conçu pour l’imagerie d’extraits dans un champ 2 dimensions (2D), mais peut être facilement étendu à l’imagerie en 3D. Il est bien adapté pour étudier la formation de motifs spatiaux dans le cytoplasme. Avec des données représentatives, nous démontrons l’organisation dynamique typique des microtubules, noyaux et mitochondries dans des extraits interphasiques préparés à l’aide de cette méthode. Ces données d’images peuvent fournir des informations quantitatives sur la dynamique cytoplasmique et l’organisation spatiale.

Introduction

Le cytoplasme constitue le volume principal d’une cellule et a une organisation distincte. Les ingrédients du cytoplasme eucaryote peuvent s’auto-assembler en un large éventail de structures spatiales, telles que les asters de microtubules et l’appareil de Golgi, qui à leur tour sont disposés dynamiquement et retournés en fonction de l’identité et de l’état physiologique de la cellule. Comprendre l’organisation spatiale du cytoplasme et son lien avec les fonctions cellulaires est donc important pour comprendre le fonctionnement de la cellule. Les extraits d’œufs de Xenopus laevis ont traditionnellement été utilisés pour des essais biochimiques en vrac

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Stanford.

1. Préparation des diapositives et des feuillets de couverture

1. Appliquez une couche de ruban adhésif d’éthylène propylène fluoré (FEP) sur une lame de verre à l’aide d’un applicateur à rouleaux. Coupez le ruban adhésif excessif sur les bords avec une lame de rasoir propre. Préparez les feuillets de couverture recouverts de ruban FEP de la même manière (Figure 1A).
2. Appliquez une entretoise d’imagerie collante double face sur le côté de la lame recouvert de....

Résultats

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis peuvent être utilisés pour étudier l’auto-organisation du cytoplasme pendant l’interphase. La figure 2A montre les résultats d’une expérience réussie. Nous avons complété des extraits arrêtés par interphase avec des noyaux de spermatozoïdes¹⁹ de Xenopus laevis à une concentration de 27 noyaux/μL et 0,38 μM de GST-GFP-NLS 27,28,29,30 purifiés (protéine de f.......

Discussion

Les extraits d’œufs de Xenopus laevis sont apparus comme un puissant système modèle pour les études basées sur l’imagerie de diverses structures subcellulaires 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 et l’organisation cytoplasmique dans son ensemble.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M