Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Zusammenfassung

Xenopus laevis-Ei-Extrakte, die traditionell für biochemische Massentests verwendet werden, haben sich zu einem leistungsstarken bildgebenden Werkzeug für die Untersuchung zytoplasmatischer Phänomene wie Zytokinese, mitotische Spindelbildung und Aufbau des Kerns entwickelt. Aufbauend auf frühen Methoden, bei denen feste Extrakte abgebildet wurden, die zu spärlichen Zeitpunkten abgetastet wurden, nähern sich neueren Ansätzen Live-Extrakten mit Zeitraffermikroskopie und zeigen dynamischere Merkmale mit verbesserter zeitlicher Auflösung. Diese Methoden erfordern in der Regel anspruchsvolle Oberflächenbehandlungen des bildgebenden Gefäßes. Hier stellen wir eine alternative Methode zur Live-Bildgebung von Ei-Extrakten vor, die keine chemische Oberflächenbehandlung erfordern. Es ist einfach zu implementieren und verwendet massenproduzierte Laborverbrauchsmaterialien für die Bildgebung. Wir beschreiben ein System, das sowohl für die Weitfeld- als auch für die konfokale Mikroskopie eingesetzt werden kann. Es ist für die Abbildung von Extrakten in einem 2-dimensionalen (2D) Feld konzipiert, kann aber leicht auf die Bildgebung in 3D erweitert werden. Es eignet sich gut zur Untersuchung der räumlichen Musterbildung im Zytoplasma. Mit repräsentativen Daten zeigen wir die typische dynamische Organisation von Mikrotubuli, Zellkernen und Mitochondrien in Interphasenextrakten, die mit dieser Methode hergestellt werden. Diese Bilddaten können quantitative Informationen über zytoplasmatische Dynamik und räumliche Organisation liefern.

Einleitung

Das Zytoplasma bildet das Hauptvolumen einer Zelle und hat eine ausgeprägte Organisation. Die Inhaltsstoffe des eukaryotischen Zytoplasmas können sich zu einer Vielzahl von räumlichen Strukturen wie Mikrotubuli-Astern und dem Golgi-Apparat zusammensetzen, die wiederum je nach Identität und physiologischem Zustand der Zelle dynamisch angeordnet und umgedreht werden. Das Verständnis der räumlichen Organisation des Zytoplasmas und seiner Verbindung zu zellulären Funktionen ist daher wichtig, um zu verstehen, wie die Zelle funktioniert. Xenopus laevis Ei-Extrakte wurden traditionell für biochemische Massentests 1,2,3,4,5,6,7,8 verwendet, aber neuere Arbeiten etablieren sie als leistungsfähiges Live-Bildgebungssystem für mechanistische Untersuchungen zytoplasmatischer Strukturen und ihrer zellulären Funktionen 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Diese unverdünnten Extrakte bewahren viele Strukturen und Funktionen des Zytoplasmas, während sie eine direkte Manipulation des zytoplasmatischen Inhalts ermöglichen, die in herkömmlichen zellbasierten Modellen nicht möglich sind^19,20. Dies macht sie ideal für die Charakterisierung zytoplasmatischer Phänomene und die Analyse ihrer mechanistischen Grundlagen.

Bestehende Methoden zur Bildgebung von Extrakten erfordern chemische Oberflächenmodifikationen oder die Herstellung von mikrofluidischen Geräten. Ein Deckglas-basiertes Verfahren erfordert die Polyethylenglykol (PEG)-Passivierung von Glasdeckgläsern²¹. Ein mikroemulsionsbasiertes Verfahren erfordert die Gasphasenabscheidung von Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan auf Glasoberflächen^22,23. Mikrofluidische Systeme ermöglichen eine präzise Kontrolle des Volumens, der Geometrie und der Zusammensetzung von Extrakttröpfchen, erfordern jedoch spezielle Mikrofabrikationsanlagen^11,12,24.

Hier stellen wir eine alternative Methode zur Abbildung von Eiextrakten vor, die einfach zu implementieren ist und leicht verfügbare, kostengünstige Materialien verwendet. Dazu gehört die Vorbereitung einer Bildkammer mit einem Objektträger und einem Deckglas, das mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP)-Band beschichtet ist. Die Kammer kann für die Bildgebung von Extrakten mit einer Vielzahl von Mikroskopiesystemen verwendet werden, einschließlich Stereoskopen und aufrechten und inversen Mikroskopen. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Behandlung von Oberflächen und erreicht gleichzeitig eine ähnliche optische Klarheit, die mit den oben beschriebenen glasbasierten Methoden erzielt wird. Es wurde entwickelt, um eine Schicht von Extrakten mit einer gleichmäßigen Dicke über ein 2D-Feld abzubilden, und kann leicht erweitert werden, um ein 3D-Volumen von Extrakten abzubilden. Es eignet sich gut für die Zeitrafferbildgebung des kollektiven zytoplasmatischen Verhaltens über ein großes Sichtfeld.

Wir haben Interphase-Arrest-Ei-Extrakte verwendet, um unsere bildgebende Methode zu demonstrieren. Die Extraktzubereitung folgt dem Protokoll von Deming und Kornbluth¹⁹. Kurz gesagt, Eier, die natürlich in der Metaphase der Meiose II blockiert werden, werden durch einen Spin mit niedriger Geschwindigkeit zerkleinert. Dieser Spin befreit das Zytoplasma aus dem meiotischen Stillstand und ermöglicht es dem Extrakt, in die Interphase überzugehen. Normalerweise wird Cytochalasin B vor dem zerkleinernden Spin hinzugefügt, um die Bildung von F-Aktinen zu hemmen. Es kann jedoch weggelassen werden, wenn F-Aktin gewünscht wird. Cycloheximid wird auch vor dem Zerkleinerungsspin hinzugefügt, um zu verhindern, dass der Interphasenextrakt in die nächste Mitose gelangt. Die Extrakte werden anschließend in die vorgenannten Bildgebungskammern gegeben und auf ein Mikroskop gelegt. Schließlich werden Bilder über die Zeit in definierten Intervallen von einer an das Mikroskop angeschlossenen Kamera aufgenommen, wodurch Zeitraffer-Bildserien entstehen, die das dynamische Verhalten des Extrakts in einem 2D-Feld erfassen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.

1. Vorbereitung von Dias und Deckgläsern

1. Tragen Sie eine Schicht fluoriertes Ethylenpropylen (FEP)-Klebeband mit einem Rollenapplikator auf einen Objektträger auf. Schneiden Sie überschüssiges Klebeband über die Kanten mit einer sauberen Rasierklinge ab. Bereiten Sie FEP-bandbeschichtete Deckgläser auf die gleiche Weise vor (Abbildung 1A).
2. Tragen Sie einen doppelseitigen, klebrigen Abstandshalter auf die mit FEP-Klebeband beschichtete Seite des Objektträgers auf. Lassen Sie die Schutzfolie auf der Oberseite ungeschält (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Objektträger und Deckgläser sollten vor dem Versuch vorbereitet werden. Sie können sofort verwendet oder in Kartons gelagert werden, um Staubansammlungen auf Oberflächen zu verhindern. Die Vertiefung im Abbildungsabstandhalter ist 120 μm tief und hat einen Durchmesser von 9 mm.

2. Herstellung und Live-Bildgebung von Interphase-Arrest-Ei-Extrakten

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Deming und Kornbluth¹⁹, Murray²⁰ und Smythe und Newport²⁵ mit Modifikationen übernommen. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Drei bis zehn Tage vor der Eizellentnahme reife weibliche Xenopus laevis Frösche subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 100 IE trächtigem Stutenserumgonadotropin (PMSG) injizieren.
2. Sechzehn bis achtzehn Stunden vor der geplanten Eizellentnahme injizieren Sie den Fröschen aus Schritt 2.1 500 IE humanes Choriongonadotropin (hCG). Frösche bei 18 °C im Eiablagepuffer (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mMMgSO4·7H2O, 2,5 mM CaCl₂·2H2O, 0,5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA) belassen, als 20x Stammlösung bei pH 7,4 vorbereiten und vor Gebrauch mit sauberem Froschtankwasser auf 1x verdünnen) bis zur Eientnahme verdünnen.
3. Sammeln Sie am Tag des Experiments Eier in einer großen Glas-Petrischale und beurteilen Sie die Eiqualität. Verwerfen Sie alle Eier, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen oder in einer Schnur erscheinen (Abbildung 1B). Untersuchen Sie die Eier unter einem Stereoskop, behalten Sie die Eier mit normalem Aussehen (Abbildung 1C) und verwerfen Sie die Eier mit unregelmäßigem oder gesprenkeltem Pigment (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Dieses Protokoll funktioniert mit Eiern, die von einem einzelnen Frosch gesammelt wurden, der typischerweise 25 ml Eier bis 16 Stunden nach der hCG-Injektion legt. In der Regel werden insgesamt 3 bis 6 Frösche durch hCG induziert, und für das Extraktpräparationsexperiment wird der Frosch mit der höchsten Eiqualität ausgewählt.
4. Die Eier in ein 400-ml-Glasbecherglas geben und durch Dekantieren so viel Eiablagepuffer wie möglich entfernen.
5. Die Eier in 100 ml frisch zubereiteter Dejelly-Lösung (2% w/v L-Cystein in Wasser, pH 8,0 mit NaOH) bebrüten und regelmäßig vorsichtig schwenken. Nach etwa 3 Minuten gießen Sie die Lösung ab und fügen Sie 100 ml frische Dejelly-Lösung hinzu. Setzen Sie die Inkubation fort, bis die Eier dicht gepackt sind (kein Abstand zwischen den Eiern), aber vermeiden Sie es, Eier länger als insgesamt 5 Minuten in der Dejelly-Lösung zu lassen.
6. Durch Dekantieren wird so viel wie möglich von der Dejelierlösung entfernt und die Eier in 0,25x MMR-Puffer (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, als 10x Stammlösung hergestellt, mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt und vor Gebrauch in Milli-Q-Wasser verdünnt) gewaschen. Die Eier schwenken und dann den Puffer abgießen. Wiederholen Sie dies einige Male, bis insgesamt 1 L des Puffers für die Wäschen verwendet wird.
7. Waschen Sie die Eier einige Male mit insgesamt 400 ml Eilysepuffer (250 mM Saccharose, 10 mM HEPES, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, frisch gemacht und mit KOH auf pH 7,7 eingestellt). Entfernen Sie Eier mit ungewöhnlichem Aussehen mit einer Pasteur-Pipette zwischen den Wäschen.
   HINWEIS: Eier mit abnormalem Aussehen beziehen sich auf solche, die wie weiße geschwollene Kugeln aussehen (Abbildung 1B), eine gesprenkelte Pigmentierung aufweisen (Abbildung 1D), sich mit einer wachsenden weißen Region verschlechtern (Abbildung 1E) oder einen dunklen und kontrahierten pigmentierten Bereich in der tierischen Hemisphäre aufweisen (Abbildung 1F).
8. Mit einer Transferpipette mit weit geöffneter Spitze werden die Eier in ein 17-ml-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt, das 1 ml Eilysepuffer enthält. Drehen Sie das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 400 x g für 15 Sekunden, um die Eier zu verpacken.
9. Entfernen Sie so viel Eierlysepuffer wie möglich mit einer Pasteur-Pipette von der Oberseite der verpackten Eier.
   HINWEIS: Es ist wichtig, so viel Puffer wie möglich aus den verpackten Eiern zu entfernen, um die Verdünnung des Eiextrakts zu minimieren. Manchmal ist es notwendig, einige lose Eier zusammen mit dem Restpuffer zu entfernen, um dies zu erreichen.
10. Bestimmen Sie das ungefähre Volumen der verpackten Eier und fügen Sie dann 5 μg / ml Aprotinin, 5 μg / ml Leupeptin, 5 μg / ml Cytochalasin B und 50 μg / ml Cycloheximid direkt auf die verpackten Eier hinzu.
    HINWEIS: Aprotinin und Leupeptin sind Proteaseinhibitoren. Cytochalasin B hemmt die Aktinpolymerisation und verhindert, dass sich der Extrakt zusammenzieht und geliert²⁶. Cycloheximid hemmt die Proteinsynthese und hält so den Extrakt in der Zwischenphase des Zellzyklus.
11. Zerkleinern Sie die Eier, indem Sie das Röhrchen bei 12.000 x g, 4 °C, 15 Minuten lang in einem schwingenden Eimerrotor zentrifugieren.
    HINWEIS: Am Ende der Zentrifugation sollten die Eier gerissen und das Lysat in drei Hauptschichten getrennt sein: eine gelbe Lipidschicht oben, der zytoplasmatische Extrakt (auch Rohextrakt genannt) in der Mitte und eine dunkle dichte Schicht mit den Pigmentkörnern unten (Abbildung 1G).
12. Befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel an einer Spritze. Mit der Abschrägung der Nadelspitze nach oben punktieren Sie das Röhrchen von der Seite am Boden der zytoplasmatischen Schicht und gewinnen Sie den Extrakt durch langsames Ziehen.
    HINWEIS: Ziehen Sie den zytoplasmatischen Extrakt langsam, um die Aufnahme von kontaminierendem Inhalt aus der gelben Lipidschicht zu vermeiden.
13. Den gewonnenen zytoplasmatischen Extrakt in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen geben und auf Eis halten. Verwenden Sie den Extrakt innerhalb von 1 Stunde.
14. Wenn Sie bereit sind, den Extrakt mit den gewünschten Reagenzien und Fluoreszenz-Bildgebungssonden zu ergänzen.
    HINWEIS: Fluoreszenzbildgebungssonden markieren spezifische zytoplasmatische Strukturen, so dass sie mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können.
15. Entfernen Sie die obere Schutzfolie aus dem Bildabstandshalter auf dem in Schritt 1.2 vorbereiteten Objektträger, und legen Sie etwa 7 μl Extrakt in der Mitte der Vertiefung ab. Tragen Sie das mit FEP-Klebeband beschichtete Deckglas sofort mit der FEP-Seite zum Extrakt auf, um das Bohrloch zu versiegeln. Fahren Sie schnell mit der Bildgebung fort (Abbildung 1H, I).
16. Stellen Sie den Objektträger auf ein inverses oder aufrechtes Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und einer Digitalkamera. Bilden Sie die Extrakte an gewünschten räumlichen Positionen und Zeitintervallen sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzkanal ab.
    HINWEIS: In der Regel wird ein 5x-Objektiv für die Bildgebung verwendet. Der motorisierte Tisch ermöglicht eine automatisierte Bildaufnahme an mehreren definierten räumlichen Positionen. Die Hellfeldmikroskopie visualisiert zytoplasmatische Strukturen mit unterschiedlichen Transparenzgraden. Die Fluoreszenzmikroskopie visualisiert die zytoplasmatischen Strukturen, die von den in Schritt 2.14 hinzugefügten Fluoreszenzbildgebungssonden spezifisch markiert wurden. Die Kamera nimmt Zeitrafferbilder dieser Strukturen auf und erfasst so die Dynamik der zytoplasmatischen Organisation.

Ergebnisse

Xenopus laevis Ei-Extrakte können verwendet werden, um die Selbstorganisation des Zytoplasmas während der Interphase zu untersuchen. Abbildung 2A zeigt die Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments. Wir ergänzten Interphase-Arrest-Extrakte mit demembranierten Xenopus laevis Spermienkernen¹⁹ in einer Konzentration von 27 Kernen/μL und 0,38 μM gereinigtem GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (Fusionsprotein bestehend aus Gluta...

Diskussion

Xenopus laevis Ei-Extrakte haben sich als leistungsfähiges Modellsystem für bildgebende Untersuchungen verschiedener subzellulärer Strukturen 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 und zytoplasmatische Organisation insgesamt herausgestellt ^...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M