アフリカツメガエル 動的細胞質組織を可視化するための卵抽出物調製およびライブイメージング法

要約

アフリカツメガエル卵からの希釈されていない細胞質抽出物の調製およびライブイメージングの方法を記載する。

要約

伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきた アフリカツメガエル 卵抽出物は、細胞質分裂、有糸分裂紡錘体形成、核の組み立てなどの細胞質現象を研究するための強力なイメージングベースのツールとして登場しています。まばらな時点でサンプリングされた固定抽出物を画像化する初期の方法に基づいて構築され、最近のアプローチは、タイムラプス顕微鏡を使用してライブ抽出を画像化し、時間分解能を高めてより動的な特徴を明らかにします。これらの方法は、通常、イメージング容器の高度な表面処理を必要とする。ここでは、化学的表面処理を必要としない卵抽出物のライブイメージングの代替方法を紹介します。実装が簡単で、大量生産された実験用消耗品をイメージングに利用します。広視野顕微鏡と共焦点顕微鏡の両方に使用できるシステムについて説明します。2次元(2D)フィールドでの抽出物のイメージング用に設計されていますが、3Dでのイメージングに簡単に拡張できます。細胞質内の空間パターン形成の研究に適しています。代表的なデータを使用して、この方法を使用して調製された間期抽出物における微小管、核、ミトコンドリアの典型的な動的組織を示します。これらの画像データは、細胞質動態や空間構成に関する定量的な情報を提供することができます。

概要

細胞質は細胞の主要な体積を構成し、明確な組織を持っています。真核生物の細胞質の成分は、微小管アスターやゴルジ体装置などの幅広い空間構造に自己組織化することができ、細胞の同一性や生理状態に応じて動的に配置され、ひっくり返されます。したがって、細胞質の空間構成と細胞機能へのリンクを理解することは、細胞がどのように機能するかを理解するために重要です。アフリカツメガエル卵抽出物は、伝統的にバルク生化学的アッセイに使用されてきました1,2,3,4,5,6,7,8、しかし最近の研究は、細胞質構造とその細胞機能の機構研究のための強力なライブイメージングシステムとして確立されています^9,10,11、 12,13,14,15,16,17,18。これらの希釈されていない抽出物は、細胞質の多くの構造と機能を保存する一方で、従来の細胞ベースのモデルでは達成できなかった細胞質内容物の直接操作を可能にします^19,20。これにより、細胞質現象を特徴付け、その機構的基盤を解剖するのに理想的です。

抽出物をイメージングするための既存の方法は、化学的表面修飾、またはマイクロ流体デバイスの製造を必要とします。カバーガラスベースの方法の1つは、ガラスカバーガラス²¹のポリエチレングリコール(PEG)パッシベーションを必要とする。マイクロエマルジョンベースの方法では、ガラス表面^22,23へのトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着が必要です。マイクロ流体ベースのシステムは、抽出液滴の量、形状および組成の正確な制御を可能にするが、特殊な微細加工設備を必要とする¹¹、^12、24。

ここでは、実施が容易で、容易に入手可能で低コストの材料を利用する卵抽出物のイメージングの代替方法を紹介します。これには、スライドとフッ素化エチレンプロピレン(FEP)テープでコーティングされたカバーガラスを備えたイメージングチャンバーの準備が含まれます。このチャンバーは、ステレオスコープや正立顕微鏡、倒立顕微鏡など、さまざまな顕微鏡システムで抽出物をイメージングするために使用できます。この方法は、表面の化学的処理を必要とせず、上記の既存のガラスベースの方法で得られるのと同様の光学的透明度を達成します。これは、2Dフィールド全体で均一な厚さの抽出物の層を画像化するように設計されており、3Dボリュームの抽出物を画像化するために簡単に拡張できます。広い視野にわたる集団細胞質挙動のタイムラプスイメージングに適しています。

我々は、イメージング方法を実証するために、間期停止卵抽出物を使用しました。抽出物の調製は、デミングおよびコーンブルース¹⁹のプロトコルに従います。簡単に言えば、減数分裂IIの中期に自然に停止した卵は、低速スピンによって押しつぶされます。このスピンは細胞質を減数分裂停止から解放し、抽出物が間期に進むことを可能にします。通常、サイトカラシンBは、F-アクチン形成を阻害するために、破砕スピンの前に添加される。但し、F-アクチンを希望する場合は省略することができる。シクロヘキシミドは、間期抽出物が次の有糸分裂に入るのを防ぐために、粉砕スピンの前にも添加されます。続いて、抽出物を前述のイメージングチャンバーに入れ、顕微鏡上に配置します。最後に、顕微鏡に接続されたカメラによって定義された間隔で画像が経時的に記録され、2Dフィールドでの抽出物の動的挙動をキャプチャするタイムラプス画像シリーズが生成されます。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1.スライドとカバーガラスの準備

1. フッ素化エチレンプロピレン(FEP)粘着テープの層をローラーアプリケーターでスライドガラスに貼り付けます。きれいなかみそりの刃で端の余分なテープを切り取ります。同じ方法でFEPテープでコーティングされたカバーガラスを準備します(図1A)。
2. 両面スティッキーイメージングスペーサーをスライドのFEPテープコーティング面に塗布します。上部の保護ライナーは剥がさずに残しておきます(図1A)。
   注意: スライドとカバーガラスは実験の前に準備する必要があります。すぐに使用することも、表面にほこりがたまるのを防ぐために箱に保管することもできます。イメージングスペーサー内のウェルは深さ120μm、直径9mmです。

2. 間期停止卵抽出物の調製とライブイメージング

注:次のプロトコルは、デミングとコーンブルース¹⁹、マ^レー20、スマイスとニューポート²⁵ から修正を加えて適応されています。すべてのステップは、特に明記されていない限り、室温で実行する必要があります。

1. 採卵の3〜10日前に、成熟した 雌のアフリカツメガエルを 100IUの妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)とともに背側リンパ嚢に皮下注射します。
2. 計画された採卵の16〜18時間前に、ステップ2.1のカエルに500IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を注射します。産卵バッファー(100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO 4·7H 2 O、2.5 mM CaCl₂·2H₂O、0.5 mM HEPES、0.1 mM EDTA)にカエルを18°Cで放置し、pH_7.4で20倍ストック溶液として調製し、使用前にきれいなカエルタンク水で1倍に希釈してから卵を採取します。
3. 実験当日、大きなガラスのペトリ皿に卵を集め、卵の品質を評価します。白いふくらんでいるボールのように見える、またはひもで現れる卵はすべて捨てます(図1B)。立体視鏡で卵を調べ、卵を通常の外観に保ち(図1C)、不規則な色素やまだらの色素を含む卵を捨てます(図1D)。
   注:このプロトコルは、通常、hCG注射後16時間までに25mLの卵を産む単一のカエルから収集された卵で機能します。通常、hCGによって合計3〜6匹のカエルが誘導され、卵の品質が最も高いカエルが抽出調製実験に選ばれます。
4. 卵を400 mLのガラスビーカーに移し、デカンテーションによってできるだけ多くの産卵バッファーを取り除きます。
5. 卵を100 mLの新しく調製したデゼリー溶液(水中で2%w / v L-システイン、NaOHでpH 8.0に調整)でインキュベートし、定期的に穏やかに回転させます。約3分後、溶液を注ぎ、100 mLの新鮮なデゼリー溶液を加えます。卵がしっかりと詰まるまで(卵の間にスペースがなくなるまで)孵卵を続けますが、合計5分以上卵を脱ゼリー溶液に残さないでください。
6. デカンテーションによりできるだけ多くの脱ゼリー溶液を除去し、0.25x MMRバッファー(25 mM NaCl、0.5 mM KCl、0.25 mM MgCl₂、0.5 mM CaCl₂、0.025 mM EDTA、1.25 mM HEPES、10xストック溶液として調製し、NaOHでpH 7.8に調整し、使用前にMilli-Q水で希釈)で卵を洗浄します。 卵を渦巻いてから、バッファーを注ぎます。合計1 Lのバッファーが洗浄に使用されるまで、数回繰り返します。
7. 合計400 mLの卵溶解バッファー(250 mMスクロース、10 mM HEPES、50 mM KCl、2.5 mM MgCl₂、1 mM DTT、新鮮にし、KOHでpH 7.7に調整)で卵を数回洗浄します。洗浄の合間にパスツールピペットを使用して異常な外観の卵を取り除きます。
   注:異常な外観の卵とは、白いふくらんでいるボールのように見える卵(図1B)、まだらの色素沈着(図1D)、白い領域の成長とともに悪化している卵(図1E)、または動物半球の黒ずみと収縮した色素沈着領域を示す卵を指します(図1F)。
8. 先端を大きく開いたトランスファーピペットを使用して、卵溶解バッファー17 mLが入った1 mLの丸底遠心チューブに卵を移します。チューブを400 x g の臨床遠心分離機で15秒間回転させて、卵を詰めます。
9. パスツールピペットを使用して、パックされた卵の上部からできるだけ多くの卵溶解バッファーを取り除きます。
   注:卵抽出物の希釈を最小限に抑えるために、パックされた卵からできるだけ多くのバッファーを除去することが重要です。これを達成するために、残留緩衝液と一緒にいくつかの緩い卵を取り除く必要がある場合があります。
10. パックされた卵のおおよその容量を決定し、5 μg / mLのアプロチニン、5 μg / mLのロイペプチン、5 μg / mLのサイトカラシンB、および50 μg / mLのシクロヘキシミドをパックされた卵の上に直接加えます。
    注:アプロチニンとロイペプチンはプロテアーゼ阻害剤です。サイトカラシンBはアクチン重合を阻害し、抽出物が収縮およびゲル化する^{のを防ぐ26}。シクロヘキシミドはタンパク質合成を阻害し、それによって抽出物を細胞周期の間期に保ちます。
11. チューブを12,000 x g、4°Cで15分間、スイングバケットローターで遠心分離して卵を粉砕します。
    注:遠心分離の終わりに、卵は破裂し、溶解物は3つの主要な層に分離しているはずです:上部の黄色の脂質層、中央の細胞質抽出物(粗抽出物とも呼ばれます)、および下部の色素顆粒を含む暗く濃い層(図1G)。
12. 18ゲージの針を注射器に取り付けます。針先ベベルを上に向けて、細胞質層の下部にある側からチューブを穿刺し、ゆっくりと描画して抽出物を回収します。
    注:黄色の脂質層からの汚染含有量が含まれないように、細胞質抽出物をゆっくりと描画します。
13. 回収した細胞質抽出物を新しいマイクロ遠心チューブに移し、氷上に保持します。1時間以内に抽出物を使用してください。
14. イメージングの準備ができたら、抽出液に目的の試薬と蛍光イメージングプローブを補充します。
    注:蛍光イメージングプローブは、特定の細胞質構造を標識して、蛍光顕微鏡で視覚化できるようにします。
15. ステップ1.2で準備したスライドのイメージングスペーサーから上部保護ライナーを取り外し、ウェルの中央に約7 μLの抽出物を堆積させます。FEP側を抽出物に向けてFEPテープでコーティングされたカバーガラスをすぐに適用し、ウェルを密封します。すぐにイメージングに進みます(図1H、I)。
16. 電動ステージとデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡または正立顕微鏡にスライドをセットします。明視野チャンネルと蛍光チャンネルの両方で、目的の空間位置と時間間隔で抽出液を画像化します。
    注:通常、5倍の対物レンズがイメージングに使用されます。電動ステージにより、複数の定義された空間位置での自動画像取得が可能です。明視野顕微鏡は、さまざまな透明度で細胞質構造を視覚化します。蛍光顕微鏡は、ステップ2.14で追加した蛍光イメージングプローブによって特異的に標識された細胞質構造を視覚化します。カメラはこれらの構造のタイムラプス画像を記録し、それによって細胞質組織のダイナミクスをキャプチャします。

結果

アフリカツメガエル卵抽出物は、間期中の細胞質の自己組織化を研究するために使用することができる。図2Aは、成功した実験の結果を示しています。間期間核の再構成と可視化を可能にするために、アフリカツメガエル精子核19を27核/μLの濃度で、0.38 μMの精製GST-GFP-NLS 27,28,29,30(グルタ

ディスカッション

アフリカツメガエル卵抽出物は、さまざまな細胞内構造^10、14、^15、16、^17、18、²¹、^31、32、33、34、^35、

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M