Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Resumen

El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.

Resumen

Se ha demostrado que los macrófagos cardíacos residentes facilitan la conducción eléctrica en el corazón. El ritmo cardíaco fisiológico se inicia por impulsos eléctricos generados en el nódulo sinoauricular (SAN) y luego se conducen a los ventrículos a través del nódulo auriculoventricular (AVN). Para estudiar más a fondo el papel de los macrófagos residentes en el sistema de conducción cardíaca, es necesario un aislamiento adecuado de los macrófagos residentes de SAN y AVN, pero sigue siendo un desafío. Aquí, proporcionamos un protocolo para la microdisección confiable de la RAS y AVN en corazones murinos seguido del aislamiento y cultivo de macrófagos residentes.

Tanto el SAN que se encuentra en la unión de la crista terminalis con la vena cava superior, como AVN, que se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, están identificados y microdisecados. La localización correcta se confirma mediante el análisis histológico del tejido realizado con tinción tricrómica de Masson y por anti-HCN4.

Los tejidos microdisecados se digieren enzimáticamente para obtener suspensiones de células individuales seguidas de la incubación con un panel específico de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos de tipo celular. Esto permite identificar, contar o aislar diferentes poblaciones celulares mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Para diferenciar los macrófagos residentes cardíacos de otras células inmunes en el miocardio, especialmente los macrófagos derivados de monocitos reclutados, se necesita una estrategia de activación delicada diseñada. Primero, las células de linaje linfoide se detectan y se excluyen de un análisis adicional. Luego, las células mieloides se identifican con macrófagos residentes que se determinan por la alta expresión de CD45 y CD11b, y la baja expresión de Ly6C. Con la clasificación celular, los macrófagos cardíacos aislados se pueden cultivar in vitro durante varios días para una mayor investigación. Por lo tanto, describimos un protocolo para aislar macrófagos residentes cardíacos ubicados dentro del sistema de conducción cardíaca. Discutimos las trampas en la microdisección y digestión de SAN y AVN, y proporcionamos una estrategia de compuerta para identificar, contar y clasificar de manera confiable los macrófagos cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Introducción

El nódulo sinoauricular (SAN) inicia fisiológicamente el impulso eléctrico y, por lo tanto, es el marcapasos primario del corazón. El nódulo auriculoventricular (AVN) conduce el impulso eléctrico desde las aurículas hasta los ventrículos y también actúa como un marcapasos subsidiario¹. En general, la generación y conducción de impulsos eléctricos es un proceso complejo que puede ser modulado por varios factores², incluyendo macrófagos residentes en regiones SAN/AVN. Un estudio reciente de Hulsmans et al. demuestra una población específica de macrófagos cardíacos residentes que se enriquecen en la AVN y funcionan como actores clave para mantener un latido cardíaco constante³. Encontraron que los macrófagos están acoplados eléctricamente a los cardiomiocitos y podrían cambiar las propiedades eléctricas de los cardiomiocitos acoplados. Los autores también señalan que tales células conductoras que se entrelazan con los macrófagos también están presentes en otros componentes del sistema de conducción cardíaca, como el SAN.

Actualmente, no se sabe completamente si el fenotipo de los macrófagos cardíacos residentes difiere entre las regiones cardíacas. Sin embargo, se ha demostrado que el microambiente tisular puede afectar la transcripción y renovación proliferativa de los macrófagos tisulares⁴. Además, dado que se ha demostrado que el fenotipo de los cardiomiocitos es diferente entre regiones, los efectos funcionales de los macrófagos sobre los cardiomiocitos también pueden ser específicos de la región, incluso si el fenotipo de macrófagos en sí puede ser el mismo. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre regiones cardíacas específicas.

Estudios recientes han demostrado que, en estado estacionario, los macrófagos residentes en el tejido se establecen prenatalmente, surgiendo independientemente de la hematopoyesis definitiva, y persisten en la edad adulta⁵. Sin embargo, después del agotamiento de macrófagos o durante la inflamación cardíaca, los monocitos^{Ly6c hi} contribuyen a reponer la población de macrófagos cardíacos⁶. Los estudios que involucran el rastreo genético del linaje, la parabiosis, el mapeo del destino y el seguimiento celular mostraron la coexistencia de una variedad de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos en órganos y tejidos, y, también, diferentes comportamientos celulares de subconjuntos de macrófagos que están potencialmente asociados con su ontogenia ^7,8,9.

La caracterización de macrófagos cardíacos residentes se ha beneficiado del uso de la clasificación de células activadas magnéticas (MACS) y la clasificación de células activadas fluorescentes. Estos métodos son particularmente útiles para aislar poblaciones celulares específicas de múltiples fracciones de tejido al etiquetarlas con sus marcadores de superficie celular. Esto no solo conduce a una mayor pureza del tipo de célula inmune aislada, sino que también permite el análisis fenotípico. Aquí, presentamos un protocolo que incluye células recubiertas de perlas magnéticas seguidas de clasificación de células activadas fluorescentes para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente aislados de la región SAN y AVN.

Para explorar las características de los macrófagos residentes cardíacos en el sistema de conducción y su función para la conducción cardíaca y la arritmogénesis, la localización y disección precisas de SAN y AVN son críticas. Para la microdisección de SAN y AVN, se utilizan puntos de referencia anatómicos para la identificación de la región¹⁰. En resumen, SAN se encuentra en la unión de la vena cava superior y la aurícula derecha. AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch, que está bordeado anteriormente por la valva septal de la válvula tricúspide, y posteriormente por el tendón de Todaro¹¹. También proporcionamos un procedimiento preciso de microdisección de SAN y AVN en ratones que se confirma mediante histología y tinción de inmunofluorescencia.

Los macrófagos residentes aislados podrían usarse para experimentos adicionales, como la secuenciación de ARN, o podrían recuperarse y cultivarse durante más de dos semanas, lo que permitiría varios experimentos in vitro. Por lo tanto, nuestro protocolo describe un procedimiento muy valioso para el inmunorritmo. La Tabla 1 muestra la composición de todas las soluciones necesarias, la Figura 1 muestra los puntos de referencia de microdisección para SAN y AVN. La Figura 2 es una ilustración esquemática de la localización de SAN y AVN. La Figura 3 muestra la tinción histológica de SAN y AVN (tinción tricrómica e inmunofluorescencia de Masson). La Figura 4 muestra una estrategia de activación paso a paso para aislar macrófagos residentes cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

Protocolo

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania. Se obtuvieron comercialmente ratones C57BL6/J.

1. Preparativos

1. Preparar el tampón de clasificación celular (Tabla 1) y almacenar a 4 °C.
   NOTA: Durante todo el procedimiento experimental, el tampón de clasificación celular siempre debe estar en hielo.
2. Prepare el tampón de digestión (Tabla 1) poco antes de la digestión, ya que la actividad de la colagenasa solo se pudo detectar durante unas pocas horas a temperatura ambiente.
3. Consulte el protocolo publicado anteriormente para la preparación de la placa de disección¹⁰. En resumen, agregue 30 ml de gel de agarosa (3% -4%) en una placa de Petri de 100 mm de diámetro y enfríe a temperatura ambiente.

2. Sacrificio de animales y escisión del corazón

1. Anestesiar al ratón con isoflurano colocándolo en una cámara de incubación conectada con un vaporizador de isoflurano y enjuagado con 5% de isoflurano / 95% de oxígeno.
2. Después de la inyección de fentanilo para analgesia, abra la caja torácica y perfunda el corazón inyectando 5-10 ml de PBS 1x helado directamente en el ventrículo izquierdo (VI). Extrae el corazón de los ratones y ponlo en el plato de disección. Los detalles experimentales se han descrito en detalle anteriormente¹⁰.

3. Microdisección de SAN y AVN

1. Después de aislar el corazón, realice los siguientes procedimientos de microdisección en la placa de disección con 1x PBS helado bajo el microscopio de disección.
2. Utilice los puntos de referencia anatómicos cardíacos, es decir, aorta, arteria pulmonar, seno coronario, ventrículo izquierdo / derecho, etc. para determinar la izquierda/derecha (izquierda: VI; derecha: VD) y anterior/posterior (anterior: aorta; posterior: seno coronario) del corazón. Después de determinar la orientación, gire alrededor del corazón con la parte frontal del mismo en el fondo del plato (para exponer las venas grandes que se encuentran en la parte posterior).
3. Microdisección de SAN
   NOTA: La microdisección de la SAN se ha descrito previamente¹⁰. El proceso se describe brevemente a continuación.
   1. Exponga la región intercava fijando los apéndices auriculares derechos (RAA) y el tejido adyacente a la vena cava superior (VCS) y la vena cava inferior (VCI) en la placa de microdisección utilizando alfileres de insectos.
   2. Cortar el corazón a lo largo del tabique interauricular paralelo a la crista terminal (TC) para separar la región intercava y obtener la muestra SAN (Figura 1A, Figura 2A). Coloque la muestra en un tubo vacío de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo.
4. Microdisección de AVN
   1. Después de la recolección de la muestra de SAN, asegúrese de que el RAA y partes de la aurícula derecha (AR) ya se hayan cortado, dejando solo el tabique interauricular (IAS) y el tabique interventricular (IVS).
   2. Fije las partes restantes del corazón a través del tejido adyacente al IAS y al IVS usando alfileres de insectos para hacer que el lado auricular derecho del IAS esté hacia arriba.
   3. Mire la aurícula derecha en la superficie endocárdica para el triángulo de Koch. Estará bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide (TV), y posteriormente por el tendón de Todaro. El orificio del seno coronario se observa en la base. (Figura 1B, Figura 2B).
   4. Corte el triángulo de Koch, que contiene el AVN, y colóquelo directamente en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml sobre hielo.

4. Digestión

1. Prepare el tampón de digestión (Tabla 1) poco antes de usarlo.
2. Picar bien el tejido SAN y AVN con bisturís.
   NOTA: Picar bien el tejido aumentará la eficiencia de la digestión y ayudará a obtener una buena suspensión celular para la clasificación. Como las muestras SAN y AVN son bastante pequeñas, se recomienda picar el tejido directamente dentro del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir la pérdida de muestra.
3. Agregue 500 μL de tampón de digestión por muestra y lave todo el tejido picado de la pared del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El pipeteo suave ayuda a digerir la muestra.
4. Homogeneizar el tubo en una máquina de vórtice (ajustes: 37 °C, 750 rpm durante 1 h).
5. Después de la digestión, transfiera la suspensión tisular a un tubo centrífugo fresco de 15 ml pasando a través de un filtro celular de 40 μm. Enjuague el colador celular con 5 ml adicionales de tampón de clasificación celular para detener la digestión.
6. Centrifugar el tubo de 15 ml a 350 x g durante 7 min a 4 °C. A continuación, retire el sobrenadante completamente con la pipeta. Resuspender el pellet celular con tampón de clasificación celular de 90 μL.
   NOTA: Antes de la separación magnética, pipetear suavemente la suspensión celular unas cuantas veces o pasar a través de un filtro celular de 30 μm para eliminar los grupos de células si es necesario, para obtener una suspensión de una sola célula para un rendimiento óptimo del enriquecimiento magnético de poblaciones celulares interesantes.

5. Enriquecimiento magnético de CD45 y tinción de muestras

NOTA: Para aislar los macrófagos cardíacos con alta eficiencia de clasificación, se realizó la exclusión de células no deseadas, incluidos los linfocitos, con microperlas CD45 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Con base en el panel de clasificación, los macrófagos residentes cardíacos se identificaron como CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6C^{bajo / int} F4/80 ^alto.

1. Añadir 10 μL de microperlas CD45 por 10⁷ células totales a la suspensión celular en el tubo de centrífuga de 15 ml. Mezclar bien las muestras e incubarlas durante 15 min a 4 °C.
   NOTA: El recuento de células con un hemocitómetro debe hacerse brevemente para asegurarse de que cada tubo no contenga más de 10⁷ células en total. Cuando se trabaja con números de células más altos, el volumen de perlas magnéticas debe ampliarse.
2. Preparar la mezcla de anticuerpos diluyendo los siguientes anticuerpos en tampón de clasificación celular (dilución 1:100 para cada anticuerpo): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI se agregará más adelante a la tinción para la discriminación de vivos / muertos.
3. Después de 15 minutos de incubación de perlas magnéticas, añadir 100 μL de mezcla de anticuerpos directamente en la suspensión celular en el tubo de 15 ml (entonces la concentración final de todos los anticuerpos es 1:200) e incubar durante 20 min a 4 °C.
4. Después de 20 minutos de incubación de anticuerpos, lavar la suspensión celular agregando 1-2 ml de tampón de clasificación celular por 10⁷ células y centrifugar a 350 x g durante 10 min. Retire completamente el sobrenadante mediante pipeteo.
5. Resuspender hasta 10⁸ células en 500 μL de tampón de clasificación celular.
   NOTA: El número máximo de células para la separación magnética debe determinarse de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Prepare el conjunto de separación magnética.
   1. Fije la columna magnética a un separador magnético adecuado y coloque un tubo de recolección debajo de la columna magnética.
   2. Prepare las columnas magnéticas enjuagando con tampón de clasificación celular: agregue 500 μL de tampón de clasificación celular en la parte superior de la columna y deje pasar el tampón.
7. Aplique la suspensión de celdas inmediatamente sobre la columna mientras pasa el búfer de clasificación de celdas.
   NOTA: Evite la formación de burbujas de aire en la columna. Según el protocolo del fabricante, aunque el tiempo de llenado de la columna puede cambiar con respecto a las condiciones de almacenamiento, no influye en la calidad de la separación.
8. Lave la columna con 3 tampón de clasificación de celdas de 500 μL. El flujo en los pasos 5.7 y 5.8 contiene celdas no marcadas, que pueden descartarse si no se necesita más experimento.
   NOTA: Agregue el búfer de clasificación de celdas inmediatamente cuando el depósito de columna esté casi vacío.
9. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección.
10. Agregue 1 ml de búfer de clasificación celular a la columna. Enjuague inmediatamente la columna aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna. El flujo a través contiene las células marcadas magnéticamente.
11. Agregue la solución DAPI a todas las suspensiones celulares etiquetadas magnéticamente recolectadas poco antes de ejecutarlas en el clasificador celular. Ajustar la concentración final de DAPI a 0,3-0,5 μg/ml.
12. Realizar análisis FACS.

6. Muestras para compensación

1. Prepare 6 tubos de microcentrífuga marrones de 1,5 ml etiquetados como "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" y "DAPI" respectivamente para proteger los anticuerpos de la luz. Prepare otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado como "sin teñir".
   NOTA: Esto podría hacerse al mismo tiempo que se incuba la suspensión celular con las microperlas y los anticuerpos. La muestra no teñida podría ser el tejido cardiomiocitario recogido al azar del tejido cardíaco preservado y también tratado de acuerdo con el paso 4.
2. Diluir cada anticuerpo conjugado con fluorescencia con tampón de clasificación celular en 1:50 en los tubos de microcentrífuga marrón de 1,5 ml que están marcados en consecuencia.
3. Añadir una gota de solución de perlas de compensación e incubar durante 20 min a 4 °C.
4. Agregue 2 ml de tampón de clasificación celular en cada tubo de microcentrífuga marrón de 1,5 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 min. Deseche completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene la perla con tampón de clasificación celular de 300 μL y transfiéralos a tubos clasificadores de células que también estén marcados en consecuencia.

7. Ejecución en el clasificador de celdas y estrategia de compuerta

1. Aplique primero la muestra sin teñir y los tubos de compensación y ajuste los voltajes de cada canal para alinear el pico positivo y negativo a la posición correcta del eje. Guarde la configuración de compensación y aplíquela a los siguientes ejemplos.
2. Aplicar las muestras en el clasificador de celdas. Establezca la estrategia de acceso como se describe en la figura 4. Los macrófagos residentes cardíacos se identifican como CD45 alto CD11b alto^CD64alto Ly6C bajo / int F4^/80^alto. DAPI se utiliza como marcador de viabilidad celular.
3. Verifique los diagramas de citometría de flujo para confirmar que la población celular de interés se muestra correctamente en los gráficos. Si no es así, ajuste el voltaje de cada canal a la vista central de cada gráfico.
4. Si los ajustes de voltaje son satisfactorios, inicie el procedimiento de clasificación. Recolectar la población celular clasificada en un medio de cultivo compuesto por DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, suplementado con 100 μg/mL de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.

8. Cultivo de macrófagos residentes

1. Después de reunir los macrófagos clasificados, transfiera las células inmediatamente a placas de cultivo de tejidos de 35 mm o a una placa de 24 pocillos, o utilícelas directamente para experimentos posteriores.
2. Para cultivar macrófagos clasificados, incubar las células a 37 °C, incubadora de_CO2 al 5%.
3. Cambiar el medio de cultivo cada 48-72 h. Las células muertas flotantes se pueden eliminar fácilmente mediante un cambio medio. Use macrófagos vivos adheridos al fondo de la placa de cultivo para el experimento posterior.

Resultados

Describimos un procedimiento práctico para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de la región SAN y AVN. Para confirmar una disección correcta, se realiza la tinción tricrómica de Masson y la tinción inmunofluorescente de HCN4 (Figura 3)¹². Con este protocolo, podríamos recolectar aproximadamente 60,000 macrófagos de un corazón completo. La figura 4 muestra la estrategia de compuerta para clasificar...

Discusión

En este manuscrito, describimos un protocolo para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de las regiones SAN y AVN a alta pureza.

Los macrófagos se dividen en subpoblaciones en función de su ubicación anatómica y fenotipo funcional. También pueden cambiar de un fenotipo funcional a otro en respuesta a señales microambientales variables¹³. En comparación con otros órganos como la médula ósea y el hígado, el tejido cardíaco co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories