Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Burada sunulan protokol, kardiyak yerleşik makrofajların fare kalplerinin sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyoventriküler düğüm (AVN) bölgesinden izolasyonu için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

Özet

Yerleşik kardiyak makrofajların kalpteki elektriksel iletimi kolaylaştırdığı gösterilmiştir. Fizyolojik kalp ritmi, sinoatriyal düğümde (SAN) üretilen elektriksel uyarılarla başlatılır ve daha sonra atriyoventriküler düğüm (AVN) yoluyla ventriküllere iletilir. Yerleşik makrofajların kardiyak iletim sistemindeki rolünü daha fazla incelemek için, yerleşik makrofajların SAN ve AVN'den uygun bir şekilde izole edilmesi gereklidir, ancak bu zor olmaya devam etmektedir. Burada, murin kalplerde SAN ve AVN'nin güvenilir mikrodiseksiyonu ve ardından yerleşik makrofajların izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz.

Hem crista terminalis'in superior vena kava ile kesiştiği noktada bulunan SAN hem de Koch üçgeninin tepesinde bulunan AVN tanımlanarak mikrodiseke edilir. Doğru yer, Masson trikrom boyası ve anti-HCN4 ile yapılan dokunun histolojik analizi ile doğrulanır.

Mikrodisseke edilmiş dokular daha sonra tek hücre süspansiyonları elde etmek için enzimatik olarak sindirilir ve ardından hücre tipi spesifik yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş spesifik bir antikor paneli ile inkübasyon yapılır. Bu, floresan aktif hücre sıralama ile farklı hücre popülasyonlarını tanımlamaya, saymaya veya izole etmeye izin verir. Kardiyak yerleşik makrofajları miyokarddaki diğer bağışıklık hücrelerinden, özellikle de işe alınan monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt etmek için, hassas bir şekilde tasarlanmış bir geçit stratejisine ihtiyaç vardır. İlk olarak, lenfoid soy hücreleri tespit edilir ve daha ileri analizlerden çıkarılır. Daha sonra, miyeloid hücreler, hem CD45 hem de CD11b'nin yüksek ekspresyonu ve Ly6C'nin düşük ekspresyonu ile belirlenen yerleşik makrofajlarla tanımlanır. Hücre sıralama ile, izole kardiyak makrofajlar daha sonra daha fazla araştırma için birkaç gün içinde in vitro olarak yetiştirilebilir. Bu nedenle, kardiyak iletim sistemi içinde bulunan kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için bir protokol tanımlıyoruz. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu ve sindirimindeki tuzakları tartışıyoruz ve floresan ile aktive olmuş hücre sıralama ile kardiyak makrofajları güvenilir bir şekilde tanımlamak, saymak ve sıralamak için bir geçit stratejisi sunuyoruz.

Giriş

Sinoatriyal düğüm (SAN) fizyolojik olarak elektriksel dürtüyü başlatır ve bu nedenle kalbin birincil kalp pilidir. Atriyoventriküler düğüm (AVN), elektriksel impulsu atriyumdan ventriküllere iletir ve ayrıca yardımcı bir kalp pili¹ görevi görür. Genel olarak, elektriksel impulsların üretimi ve iletimi, SAN / AVN bölgelerindeki yerleşik makrofaj da dahil olmak üzere çeşitli faktörler² tarafından modüle edilebilen karmaşık bir süreçtir. Hulsmans ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışma, AVN'de zenginleştirilmiş ve sabit bir kalp atışı^3'ü tutmada kilit oyuncular olarak işlev gören belirli bir kardiyak yerleşik makrofajlar popülasyonunu göstermektedir. Makrofajların elektriksel olarak kardiyomiyositlere bağlandığını ve kuplajlı kardiyomiyositlerin elektriksel özelliklerini değiştirebileceğini bulmuşlardır. Yazarlar ayrıca, makrofajlarla iç içe geçen bu tür iletken hücrelerin, SAN gibi kardiyak iletim sisteminin diğer bileşenlerinde de bulunduğunu belirtmektedir.

Şu anda, yerleşik kardiyak makrofajların fenotipinin kardiyak bölgeler arasında farklılık gösterip göstermediği tam olarak bilinmemektedir. Bununla birlikte, doku mikroçevresinin doku makrofajlarının transkripsiyonunu ve proliferatif yenilenmesini etkileyebileceği gösterilmiştir⁴. Ayrıca, kardiyomiyosit fenotipinin bölgeler arasında farklı olduğu gösterildiğinden, makrofajların kardiyomiyositler üzerindeki fonksiyonel etkileri, makrofaj fenotipinin kendisi aynı olsa bile, bölgeye özgü olabilir. Bu nedenle, belirli kardiyak bölgeler üzerinde daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kararlı durumda, dokuda yerleşik makrofajların prenatal olarak kurulduğunu, kesin hematopoezden bağımsız olarak ortaya çıktığını ve yetişkinliğe kadar devam ettiğini göstermiştir⁵. Bununla birlikte, makrofaj tükenmesinden sonra veya kardiyak inflamasyon sırasında, Ly6c^hi monositleri kardiyak makrofaj popülasyonunun yenilenmesine katkıda bulunur⁶. Genetik soy izleme, parabiyoz, kader haritalama ve hücre izlemeyi içeren çalışmalar, organ ve dokularda çeşitli doku yerleşik makrofaj popülasyonlarının bir arada bulunduğunu ve ayrıca ontojeni 7,8,9 ile potansiyel olarak ilişkili makrofaj alt kümelerinin farklı hücresel davranışlarını göstermiştir.

Yerleşik kardiyak makrofajların karakterizasyonu, manyetik aktif hücre sıralama (MACS) ve floresan aktif hücre sıralama kullanımından yararlanmıştır. Bu yöntemler, spesifik hücre popülasyonlarını, hücre yüzey belirteçleriyle etiketleyerek çoklu doku fraksiyonlarından izole etmek için özellikle yararlıdır. Bu sadece izole edilmiş bağışıklık hücresi tipinin daha yüksek saflığına yol açmakla kalmaz, aynı zamanda fenotipik analize de izin verir. Burada, manyetik boncuk kaplı hücreleri içeren bir protokol ve ardından SAN ve AVN bölgesinden özel olarak izole edilen kardiyak yerleşik makrofajların zenginleştirilmesi için floresan aktif hücre ayıklama ile birlikte sunulmaktadır.

İletim sistemindeki kardiyak yerleşik makrofajların özelliklerini ve kardiyak iletim ve aritmiyogenez fonksiyonlarını araştırmak için, SAN ve AVN'nin kesin lokalizasyonu ve diseksiyonu kritik öneme sahiptir. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu için, bölge tanımlaması için anatomik işaretler kullanılır¹⁰. Kısacası SAN, superior vena kava ile sağ atriyumun birleştiği noktada yer almaktadır. AVN, triküspid kapağın septal broşürü ve arkadan Todaro^11'in tendonu ile ön sınırlanan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Ayrıca farelerde SAN ve AVN'nin histoloji ve immünofloresan boyama ile doğrulanan doğru bir mikrodiseksiyon prosedürünü de sağlıyoruz.

İzole edilmiş yerleşik makrofajlar, RNA dizilimi gibi daha ileri deneyler için kullanılabilir veya çeşitli in vitro deneylere izin vererek iki haftadan fazla bir süre boyunca geri kazanılabilir ve yetiştirilebilir. Bu nedenle, protokolümüz immüno-ritmolog için oldukça değerli bir prosedürü tanımlamaktadır. Tablo 1, ihtiyaç duyulan tüm çözümlerin bileşimini gösterir, Şekil 1 , SAN ve AVN için mikrodiseksiyon işaretlerini gösterir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin histolojik boyanmasını göstermektedir (Masson'un trikrom ve immünofloresan boyaması). Şekil 4 , floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile kardiyak yerleşik makrofajları izole etmek için adım adım bir geçit stratejisi göstermektedir.

Protokol

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır. C57BL6/J fareler ticari olarak elde edildi.

1. Hazırlıklar

1. Hücre sıralama arabelleğini hazırlayın (Tablo 1) ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Tüm deneysel prosedür boyunca, hücre sıralama tamponu her zaman buz üzerinde olmalıdır.
2. Sindirim tamponunu hazırlayın (Tablo 1) sindirimden kısa bir süre önce, kollajenazın aktivitesi oda sıcaklığında sadece birkaç saat tespit edilebildiğinden.
3. Diseksiyon çanağı^10'un hazırlanması için daha önce yayınlanmış protokole bakınız. Kısacası, 100 mm çapında bir Petri kabına 30 mL agaroz jeli (% 3-4) ekleyin ve oda sıcaklığında soğutun.

2. Hayvan kurban ve kalp eksizyonu

1. Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı ve %5 izofluran/%95 oksijen ile yıkanmış bir kuluçka odasına yerleştirerek izofluran ile uyuşturun.
2. Analjezi için fentanil enjeksiyonundan sonra, göğüs kafesini açın ve 5-10 mL buz gibi soğuk 1x PBS'yi doğrudan sol ventriküle (LV) enjekte ederek kalbi perfüze edin. Farelerin kalbini çıkarın ve diseksiyon kabına koyun. Deneysel detaylar daha önce¹⁰ ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

3. SAN ve AVN'nin mikrodiseksiyonu

1. Kalbi izole ettikten sonra, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk 1x PBS ile diseksiyon kabında aşağıdaki mikrodiseksiyon prosedürlerini uygulayın.
2. Kardiyak anatomik yer işaretlerini kullanın, yani aort, pulmoner arter, koroner sinüs, sol / sağ ventrikül, vb. kalbin solunu/sağını (sol: LV; sağ: RV) ve anterior/posteriorunu (anterior: aort; posterior: koroner sinüs) belirlemek. Oryantasyon belirlendikten sonra, kalbin etrafında, tabağın dibinde önü olacak şekilde çevirin (posteriorda bulunan büyük damarları ortaya çıkarmak için).
3. SAN'ın mikrodiseksiyonu
   NOT: SAN'ın mikrodiseksiyonu daha önce tarif edilmiştir¹⁰. İşlem aşağıda kısaca açıklanmıştır.
   1. Sağ atriyal ekleri (RAA) ve superior vena kava (SVC) ve inferior vena kava'ya (IVC) bitişik dokuyu böcek pimleri kullanarak mikrodiseksiyon kabı üzerine sabitleyerek inter-kaval bölgeyi açığa çıkarın.
   2. Kavaller arası bölgeyi ayırmak ve SAN örneğini elde etmek için kalbi krista terminalise (BT) paralel olarak interatriyal septum boyunca kesin (Şekil 1A, Şekil 2A). Numuneyi buz üzerinde boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe koyun.
4. AVN'nin mikrodiseksiyonu
   1. SAN örneğinin toplanmasından sonra, RAA ve sağ atriyumun (RA) parçalarının zaten kesilmiş olduğundan emin olun, sadece interatriyal septum (IAS) ve interventriküler septum (IVS) bırakılır.
   2. Kalbin kalan kısımlarını, IAS'nin sağ atriyal tarafını yukarı bakacak şekilde yapmak için böcek pimleri kullanarak IAS ve IVS'ye bitişik dokudan geçirin.
   3. Koch üçgeni için endokardiyal yüzeydeki sağ atriyuma bakın. Ön tarafta, triküspid kapağın (TV) septal broşürünün menteşe çizgisi ve arkadan Todaro tendonu ile sınırlanacaktır. Koroner sinüsün deliği tabanda gözlenir. (Şekil 1B, Şekil 2B).
   4. AVN'yi içeren Koch üçgenini kesin ve doğrudan buz üzerinde boş bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne koyun.

4. Sindirim

1. Sindirim tamponunu (Tablo 1) kullanımdan kısa bir süre önce hazırlayın.
2. SAN ve AVN dokusunu neşterlerle iyice doğrayın.
   NOT: Dokuyu iyice kıymak, sindirim verimliliğini artıracak ve sıralama için iyi hücre süspansiyonu elde etmeye yardımcı olacaktır. SAN ve AVN numuneleri oldukça küçük olduğundan, numune kaybını azaltmak için dokunun doğrudan 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün içine kıyılması önerilir.
3. Numune başına 500 μL sindirim tamponu ekleyin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün duvarından tüm kıyılmış dokuları yıkayın. Nazik pipetleme numunenin sindirilmesine yardımcı olur.
4. Tüpü bir vorteks makinesinde homojenize edin (ayarlar: 37 °C, 1 saat için 750 rpm).
5. Sindirimden sonra, doku süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek taze bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi durdurmak için hücre süzgecini ilave 5 mL hücre sıralama tamponu ile durulayın.
6. 15 mL tüpü 350 x g'de 4 ° C'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından pipeti kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın. Hücre peletini 90 μL hücre sıralama tamponu ile yeniden askıya alın.
   NOT: Manyetik ayırmadan önce, ilginç hücre popülasyonlarının manyetik zenginleştirilmesinin optimum performansı için tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere, gerekirse hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu birkaç kez hafifçe pipetleyin veya 30 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.

5. CD45'in manyetik zenginleştirilmesi ve numune boyama

NOT: Kardiyak makrofajları yüksek ayıklama etkinliği ile izole etmek için, lenfositler de dahil olmak üzere istenmeyen hücrelerin dışlanması, üreticinin protokolüne göre CD45 mikroboncukları ile gerçekleştirildi. Sıralama paneline dayanarak, kardiyak yerleşik makrofajlar CD45 yüksek CD11b yüksek CD64^yüksek Ly6C düşük/int F4^/80^yüksekolarak tanımlandı.

1. 15 mL santrifüj tüpündeki hücre süspansiyonuna 10⁷ toplam hücre başına 10 μL CD45 mikroboncuk ekleyin. Numuneleri iyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı, her tüpün toplam 10^7'den fazla hücre içermediğinden emin olmak için kısaca yapılmalıdır. Daha yüksek hücre numaralarıyla çalışırken, manyetik boncukların hacminin büyütülmesi gerekir.
2. Hücre sıralama tamponunda aşağıdaki antikorları seyrelterek antikor karışımını hazırlayın (her antikor için 1:100 seyreltme): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI daha sonra canlı/ölü ayrımcılığı için boyamaya eklenecektir.
3. 15 dakikalık manyetik boncuk inkübasyonundan sonra, 15 mL tüpteki hücre süspansiyonuna doğrudan 100 μL antikor karışımı ekleyin (daha sonra tüm antikorların nihai konsantrasyonu 1:200'dür) ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
4. 20 dakikalık antikor inkübasyonundan sonra, 10⁷ hücre başına 1-2 mL hücre sıralama tamponu ekleyerek hücre süspansiyonunu yıkayın ve 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı pipetle tutarak tamamen çıkarın.
5. 500 μL hücre sıralama arabelleğinde 10^{adede kadar 8} hücreyi yeniden askıya alın.
   NOT: Manyetik ayırma için maksimum hücre sayısı, üreticinin protokolüne göre belirlenmelidir.
6. Manyetik ayırma setini hazırlayın.
   1. Manyetik kolonu uygun bir manyetik ayırıcıya takın ve manyetik sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin.
   2. Manyetik sütunları hücre sıralama tamponuyla durulayarak hazırlayın: sütunun üstüne 500 μL hücre sıralama arabelleği ekleyin ve arabelleğin geçmesine izin verin.
7. Hücre sıralama arabelleği geçerken hücre süspansiyonunu hemen sütuna uygulayın.
   NOT: Kolonda hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Üreticinin protokolüne göre, kolon doldurma süresi depolama koşullarından değişebilse de, ayırmanın kalitesi üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
8. Kolonu 3 x 500 μL hücre sıralama tamponuyla yıkayın. Adım 5.7 ve adım 5.8'deki akış, başka bir deneye gerek yoksa atılabilen etiketsiz hücreler içerir.
   NOT: Sütun deposu neredeyse boşaldığında hücre sıralama arabelleğini hemen ekleyin.
9. Kolonu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
10. Sütuna 1 mL hücre sıralama arabelleği ekleyin. Kolon ile birlikte verilen pistonu sıkıca uygulayarak kolonu hemen yıkayın. Akış, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri içerir.
11. DAPI çözeltisini, toplanan manyetik olarak etiketlenmiş tüm hücre süspansiyonlarına, hücre sıralayıcısında çalıştırmadan kısa bir süre önce ekleyin. DAPI'nin son konsantrasyonunu 0,3-0,5 μg/mL'ye ayarlayın.
12. FACS analizi gerçekleştirin.

6. Tazminat için örnekler

1. Antikorları ışıktan korumak için sırasıyla "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" ve "DAPI" olarak etiketlenmiş 6 kahverengi 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. "Lekesiz" olarak etiketlenmiş bir adet daha 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
   NOT: Bu, hücre süspansiyonunun mikroboncuklar ve antikorlarla inkübe edilmesiyle aynı anda yapılabilir. Lekesiz örnek, korunmuş kalp dokusundan rastgele toplanan ve ayrıca adım 4'e göre tedavi edilen kardiyomiyosit dokusu olabilir.
2. Her bir floresan konjuge antikoru, buna göre işaretlenmiş 1.5 mL kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde hücre sıralama tamponu ile 1:50'ye seyreltin.
3. Bir damla kompanzasyon boncuk çözeltisi ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
4. Her 1,5 mL kahverengi mikrosantrifüj tüpüne 2 mL hücre ayırma tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen atın ve 300 μL hücre sıralama tamponu ile pelet içeren boncuk içeren resuda alın ve bunları da buna göre işaretlenmiş hücre sıralayıcı tüplerine aktarın.

7. Hücre sıralayıcısı ve geçit stratejisi üzerinde çalışmak

1. Önce lekesiz numune ve kompanzasyon tüplerini uygulayın ve hem pozitif hem de negatif tepeyi eksenin uygun konumuna hizalamak için her kanalın voltajlarını ayarlayın. Ücret ayarlarını kaydedin ve aşağıdaki örneklere uygulayın.
2. Örnekleri hücre sıralayıcısına uygulayın. Geçit stratejisini Şekil 4'te açıklandığı gibi ayarlayın. Kardiyak yerleşimli makrofajlar CD45 yüksek CD11b yüksek CD64 yüksek Ly6C^düşük/int F4/80^yüksekolarak tanımlanır. DAPI, hücre canlılığı belirteci olarak kullanılır.
3. İlgilenilen hücre popülasyonunun grafiklerde düzgün bir şekilde gösterildiğini onaylamak için akış sitometrisi grafiklerini kontrol edin. Değilse, her kanalın voltajını her grafiğin merkez görünümüne ayarlayın.
4. Voltaj ayarları tatmin ediciyse, sıralama prosedürünü başlatın. Sıralanmış hücre popülasyonunu, 100 μg / mL streptomisin ve 100 U / mL penisilin ile desteklenen% 10 fetal sığır serumu içeren DMEM'den oluşan kültür ortamına toplayın.

8. Yerleşik makrofajlar kültürü

1. Sıralanmış makrofajları topladıktan sonra, hücreleri derhal 35 mm doku kültürü kaplarına veya 24 kuyucuk plakasına aktarın veya sonraki deneyler için doğrudan kullanın.
2. Makrofajları kültüre ayırmak için, hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
3. Kültür ortamını her 48-72 saatte bir değiştirin. Yüzen ölü hücreler orta değişimle kolayca çıkarılabilir. Sonraki deneyler için kültür kabının dibine tutturulmuş canlı makrofajlar kullanın.

Sonuçlar

Kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgesinden izolasyonu için pratik bir prosedür tanımladık. Doğru diseksiyonu doğrulamak için, Masson Trikrom boyama ve immünofloresan HCN4-boyama yapılır (Şekil 3)¹². Bu protokolle, bütün bir kalpten yaklaşık 60.000 makrofaj toplayabiliriz. Şekil 4, kardiyak makrofajları sıralamak için geçit stratejisini göstermektedir. Canlı yerleşimli kardiyak makrofajlar C...

Tartışmalar

Bu yazıda, kardiyak yerleşik makrofajların özellikle SAN ve AVN bölgelerinden yüksek saflıkta zenginleştirilmesi için bir protokol anlatılmaktadır.

Makrofajlar anatomik konumlarına ve fonksiyonel fenotiplerine göre alt popülasyonlara ayrılırlar. Ayrıca, değişken mikroçevresel sinyallere yanıt olarak bir fonksiyonel fenotipten diğerine geçebilirler¹³. Kemik iliği ve karaciğer gibi diğer organlarla karşılaştırıldığında, kalp dokusu daha d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories