쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

요약

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

초록

상주 심장 대 식세포는 심장에서 전기 전도를 촉진하는 것으로 입증되었습니다. 생리적 심장 리듬은 동방 결절 (SAN)에서 생성 된 전기 충격에 의해 시작된 다음 방실 결절 (AVN)을 통해 심실로 전달됩니다. 심장 전도 시스템에서 상주 대식세포의 역할을 더 연구하려면 SAN 및 AVN에서 상주 대식세포를 적절하게 분리해야 하지만 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 쥐 심장에서 SAN 및 AVN의 신뢰할 수 있는 미세 해부를 위한 프로토콜을 제공하고 상주 대식세포의 분리 및 배양을 제공합니다.

크리스타 터미널과 상대 정맥의 교차점에 위치한 SAN과 Koch의 삼각형 정점에 위치한 AVN이 모두 식별되고 미세 해부됩니다. 정확한 위치는 Masson의 삼색 염색 및 항 -HCN4로 수행 된 조직의 조직 학적 분석에 의해 확인됩니다.

그런 다음 미세 해부 조직을 효소적으로 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포 유형 특정 표면 마커에 대해 지시된 특정 항체 패널과 함께 배양합니다. 이를 통해 형광 활성화 세포 분류를 통해 서로 다른 세포 집단을 식별, 계수 또는 분리할 수 있습니다. 심장 상주 대식세포를 심근의 다른 면역 세포, 특히 모집된 단핵구 유래 대식세포와 구별하기 위해서는 섬세하게 고안된 게이팅 전략이 필요합니다. 첫째, 림프 계통 세포를 검출하고 추가 분석에서 제외합니다. 이어서, 골수성 세포는 CD45 및 CD11b 둘 다의 높은 발현 및 Ly6C의 낮은 발현에 의해 결정되는 상주 대식세포로 확인된다. 세포 분류를 통해 분리된 심장 대식세포를 추가 조사를 위해 며칠 동안 시험관내에서 배양할 수 있습니다. 따라서 우리는 심장 전도 시스템 내에 위치한 심장 상주 대 식세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SAN 및 AVN의 미세 해부 및 소화의 함정에 대해 논의하고 형광 활성화 세포 분류를 통해 심장 대 식세포를 안정적으로 식별, 계수 및 분류하는 게이팅 전략을 제공합니다.

서문

동방 결절 (SAN)은 생리 학적으로 전기 충격을 시작하므로 심장의 주요 맥박 조정기입니다. 방실 결절 (AVN)은 심방에서 심실로 전기 충격을 전달하고 보조 심박 조율기¹로도 작용합니다. 일반적으로, 전기 충격의 생성 및 전도는 SAN/AVN 영역의 상주 대식세포를 포함하는 다양한 인자²에 의해 조절될 수 있는 복잡한 과정이다. Hulsmans et al.의 최근 연구는 AVN이 풍부하고 꾸준한 심장 박동을 유지하는 데 핵심 역할을 하는 심장 상주 대식세포의 특정 집단을^{보여줍니다3.} 그들은 대 식세포가 심근 세포에 전기적으로 결합되어 결합 된 심근 세포의 전기적 특성을 변화시킬 수 있음을 발견했습니다. 저자들은 또한 대식세포와 인터리빙하는 이러한 전도성 세포가 SAN과 같은 심장 전도 시스템의 다른 구성 요소에도 존재한다는 점에 주목합니다.

현재, 상주 심장 대 식세포의 표현형이 심장 영역마다 다른지 여부는 완전히 알려져 있지 않습니다. 그러나, 조직 미세 환경이 조직 대 식세포의 전사 및 증식 재생에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다⁴. 또한, 심근세포 표현형이 영역마다 상이한 것으로 입증되었기 때문에, 심근세포에 대한 대식세포의 기능적 효과는 대식세포 표현형 자체가 동일할 수 있다 하더라도 또한 영역-특이적일 수 있다. 따라서 특정 심장 부위에 대한 추가 연구가 필요합니다.

최근 연구에 따르면 정상 상태에서 조직 상주 대식세포는 태아기에 확립되어 최종 조혈과 독립적으로 발생하며 성인기까지^{지속됩니다5.} 그러나, 대식세포 고갈 후 또는 심장 염증 동안, Ly6c^hi 단핵구는 심장 대식^{세포 집단을} 보충하는데 기여한다6. 유전적 계통 추적, parabiosis, 운명 매핑 및 세포 추적과 관련된 연구는 장기 및 조직에 다양한 조직 상주 대식세포 집단의 공존, 그리고 또한 잠재적으로 그들의 개체 발생과 관련된 대식세포 하위 세트의 상이한 세포 행동을 보여주었다 ^7,8,9.

상주 심장 대식세포의 특성화는 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류의 사용으로부터 이익을 얻었습니다. 이러한 방법은 세포 표면 마커로 표지하여 여러 조직 분획으로부터 특정 세포 집단을 분리하는 데 특히 유용합니다. 이는 분리된 면역 세포 유형의 순도를 높일 뿐만 아니라 표현형 분석도 가능하게 합니다. 여기에서는 SAN 및 AVN 영역으로부터 특이적으로 분리된 심장 상주 대식세포의 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류와 함께 자성 비드 코팅 세포를 포함하는 프로토콜을 제시합니다.

전도 시스템에서 심장 상주 대식세포의 특성과 심장 전도 및 부정맥 발생에 대한 기능을 탐구하려면 SAN 및 AVN의 정확한 위치 파악 및 해부가 중요합니다. SAN 및 AVN의 미세 해부를 위해, 해부학적 랜드마크가 영역 식별(¹⁰)에 사용된다. 간단히 말해서, SAN은 상대 정맥과 우심방의 교차점에 위치합니다. AVN은 Koch의 삼각형 내에 위치하고 있으며, 앞쪽으로는 삼첨판 막의 중격 전단지와 접해 있고 뒤쪽으로는 Todaro¹¹의 힘줄에 의해 접해 있습니다. 우리는 또한 조직학 및 면역 형광 염색으로 확인 된 마우스에서 SAN 및 AVN의 정확한 미세 해부 절차를 제공합니다.

분리된 상주 대식세포는 RNA 시퀀싱과 같은 추가 실험에 사용되거나 다양한 시험관 내 실험을 허용할 수 있도록 2주 이상 회수 및 배양될 수 있습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 면역 리듬 학자에게 매우 가치있는 절차를 설명합니다. 표 1은 필요한 모든 용액의 조성을 보여주고, 도 1 은 SAN 및 AVN에 대한 미세해부 랜드마크를 나타낸다. 도 2 는 SAN 및 AVN 국소화의 개략도이다. 도 3 은 SAN 및 AVN의 조직학적 염색(Masson's trichrome 및 면역형광 염색)을 나타낸다. 도 4 는 형광-활성화 세포 분류에 의해 심장 상주 대식세포를 분리하기 위한 단계별 게이팅 전략을 나타낸다.

프로토콜

동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨의 바이에른 정부의 승인을 받았습니다. C57BL6/J 마우스를 상업적으로 입수하였다.

1. 준비

1. 세포 분류 완충액(표 1)을 준비하고 4°C에서 보관한다.
   참고: 전체 실험 절차 동안 세포 분류 버퍼는 항상 얼음 위에 있어야 합니다.
2. 콜라게나제의 활성이 실온에서 수 시간 동안만 검출될 수 있었던 것처럼 소화 직전에 소화 완충액(표 1)을 준비하였다.
3. 해부 접시¹⁰의 준비에 대해서는 이전에 발표 된 프로토콜을 참조하십시오. 간단히 말해서 30mL의 아가로스 겔(3%-4%)을 직경 100mm 페트리 접시에 넣고 실온에서 식힙니다.

2. 동물 희생 및 심장 절제

1. 마우스를 이소플루란 기화기로 연결된 배양 챔버에 넣고 5% 이소플루란/95% 산소로 플러싱하여 이소플루란으로 마취합니다.
2. 진통제를 위해 펜타닐을 주사 한 후 흉곽을 열고 5-10mL의 얼음처럼 차가운 1x PBS를 좌심실 (LV)에 직접 주입하여 심장을 관류합니다. 생쥐 심장을 추출하여 해부 접시에 올려 놓으십시오. 실험 세부사항은 앞서¹⁰에서 상세히 설명하였다.

3. SAN 및 AVN의 미세 해부

1. 심장을 분리 한 후 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 1x PBS로 해부 접시에서 다음 미세 해부 절차를 수행하십시오.
2. 심장 해부학적 랜드마크, 즉 대동맥, 폐동맥, 관상동맥, 좌/우심실 등을 사용합니다. 심장의 왼쪽/오른쪽(왼쪽: LV, 오른쪽: RV) 및 전방/후방(전방: 대동맥, 후방: 관상동)을 결정합니다. 방향이 결정된 후, 접시의 바닥에 앞쪽으로 심장을 돌립니다 (뒤쪽에있는 큰 정맥을 노출시키기 위해).
3. SAN의 미세 해부
   참고 : SAN의 미세 해부는 이전에 설명되었습니다¹⁰. 이 프로세스는 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
   1. 곤충 핀을 사용하여 미세 해부 접시에 우심방 부속기(RAA)와 상대정맥(SVC) 및 하대정맥(IVC)에 인접한 조직을 고정하여 기갑간 영역을 노출합니다.
   2. 크리스타 말단 (CT)과 평행 한 심방 중격을 따라 심장을 절단하여 기층 간 영역을 분리하고 SAN 샘플을 얻습니다 (그림 1A, 그림 2A). 얼음 위의 빈 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 샘플을 넣습니다.
4. AVN의 미세 해부
   1. SAN 샘플 수집 후 RAA 및 우심방 (RA)의 일부가 이미 절단되어 심방 중격 (IAS) 및 심실 중격 (IVS) 만 남았는지 확인하십시오.
   2. 곤충 핀을 사용하여 IAS 및 IVS에 인접한 조직을 통해 심장의 나머지 부분을 고정하여 IAS의 오른쪽 심방이 위를 향하도록 합니다.
   3. Koch의 삼각형에 대한 심내막 표면의 우심방을보십시오. 그것은 삼첨판 막 (TV)의 중격 전단지의 힌지 라인에 의해 앞쪽으로, 그리고 Todaro의 힘줄에 의해 뒤쪽으로 접할 것입니다. 관상 동맥의 구멍이 기저부에서 관찰됩니다. (그림 1B, 그림 2B).
   4. AVN이 포함 된 Koch의 삼각형을 잘라 얼음 위의 빈 1.5mL 미세 원심 분리기 튜브에 직접 넣습니다.

4. 소화

1. 사용 직전에 소화 완충액(표 1)을 준비하십시오.
2. 메스로 SAN과 AVN 조직을 잘 다진다.
   참고: 조직을 잘 다지면 소화 효율이 증가하고 분류를 위한 좋은 세포 현탁액을 얻는 데 도움이 됩니다. SAN 및 AVN 샘플은 매우 작기 때문에 샘플 손실을 줄이기 위해 1.5mL 미세 원심분리 튜브 내부에서 직접 조직을 다지는 것이 좋습니다.
3. 시료당 500μL의 분해 완충액을 추가하고 1.5mL 미세 원심분리 튜브의 벽에서 다진 조직을 모두 씻어냅니다. 부드러운 피펫팅은 시료 소화에 도움이 됩니다.
4. 와류 기계에서 튜브를 균질화합니다(설정: 37°C, 1시간 동안 750rpm).
5. 소화 후 40μm 세포 여과기를 통과하여 조직 현탁액을 새로운 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 여과기를 추가로 5mL의 세포 분류 완충액으로 헹구어 소화를 중지합니다.
6. 15mL 튜브를 350 x g 로 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하십시오. 90 μL 세포 분류 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   참고: 자기 분리 전에 세포 현탁액을 부드럽게 몇 번 피펫팅하거나 필요한 경우 30μm 세포 스트레이너를 통과하여 세포 덩어리를 제거하여 흥미로운 세포 집단의 자기 농축 성능을 최적화하기 위한 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

5. CD45의 자기 농축 및 샘플 염색

참고: 높은 분류 효율로 심장 대식세포를 분리하기 위해, 림프구를 포함한 바람직하지 않은 세포의 배제를 제조자의 프로토콜에 따라 CD45 마이크로비드로 수행하였다. 분류 패널에 기초하여, 심장 상주 대식세포는 CD45 높은 CD11b 높은 CD64 높은 Ly6C^낮은/int F4/80 ^높은것으로 확인되었다.

1. 총 세포 7개당 10μL의 CD45 마이크로비드를 15mL 원심분리 튜브의 세포 현탁액에 추가합니다. 샘플을 잘 혼합하고 4 ° C에서 15 분 동안 배양합니다.
   알림: 혈구계를 사용한 세포 계수는 각 튜브에 총 10^개 이하의 7 개의 세포가 포함되어 있는지 간략하게 수행해야합니다. 더 높은 셀 번호로 작업할 때는 마그네틱 비드의 부피를 늘려야 합니다.
2. 다음 항체를 세포 분류 완충액(각 항체에 대해 1:100 희석)으로 희석하여 항체 혼합물을 제조한다: CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI는 나중에 살아있는 / 죽은 차별에 대한 염색에 추가됩니다.
3. 15분의 마그네틱 비드 배양 후 100μL의 항체 혼합물을 15mL 튜브의 세포 현탁액에 직접 추가하고(모든 항체의 최종 농도는 1:200임) 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
4. 항체 인큐베이션 20분 후, 10⁷ 세포당 1-2mL의 세포 분류 완충액을 추가하고 350 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포 현탁액을 세척합니다. 피펫팅으로 상청액을 완전히 제거합니다.
5. 500 μL의 세포 분류 완충액에 최대 10개의⁸ 개 세포를 재현탁합니다.
   알림: 자기 분리를 위한 최대 셀 수는 제조업체의 프로토콜에 따라 결정해야 합니다.
6. 자기 분리 세트를 준비하십시오.
   1. 자성 컬럼을 적절한 자기 분리기에 부착하고 자성 기둥 아래에 수집 튜브를 놓습니다.
   2. 세포 분류 버퍼로 헹구어 마그네틱 컬럼 준비: 컬럼 상단에 500μL의 셀 분류 버퍼를 추가하고 버퍼가 통과하도록 합니다.
7. 세포 분류 버퍼가 통과하는 동안 세포 현탁액을 컬럼에 즉시 적용합니다.
   알림: 컬럼에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 컬럼 충전 시간이 보관 조건에 따라 변경될 수 있지만 분리 품질에는 영향을 미치지 않습니다.
8. 컬럼을 3 x 500 μL 세포 분류 완충액으로 세척합니다. 5.7단계 및 5.8단계의 플로우스루에는 표지되지 않은 세포가 포함되어 있으며, 추가 실험이 필요하지 않은 경우 폐기할 수 있습니다.
   참고: 컬럼 저장소가 거의 비어 있을 때 즉시 셀 정렬 버퍼를 추가합니다.
9. 자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 놓습니다.
10. 컬럼에 세포 분류 버퍼 1mL를 추가합니다. 컬럼과 함께 제공된 플런저를 단단히 적용하여 컬럼을 즉시 세척하십시오. 유동 관통은 자기적으로 표지된 세포를 포함한다.
11. 세포 분류기에서 실행하기 직전에 수집된 모든 자기 표지 세포 현탁액에 DAPI 용액을 추가합니다. DAPI의 최종 농도를 0.3-0.5 μg/mL로 조정합니다.
12. FACS 분석을 수행합니다.

6. 보상을 위한 표본

1. 빛으로부터 항체를 보호하기 위해 각각 "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" 및 "DAPI"로 표시된 6개의 갈색 1.5mL 미세 원심분리 튜브를 준비합니다. "염색되지 않음"으로 표시된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 하나 더 준비하십시오.
   참고: 이것은 세포 현탁액을 마이크로비드 및 항체와 함께 인큐베이션하는 것과 동시에 수행될 수 있습니다. 염색되지 않은 샘플은 예비 심장 조직으로부터 무작위로 수집되고 또한 단계 4에 따라 처리된 심근세포 조직일 수 있다.
2. 세포 분류 완충액이 있는 각 단일 형광 접합 항체를 그에 따라 표시된 1.5mL 갈색 미세 원심분리 튜브에서 1:50으로 희석합니다.
3. 보상 비드 용액 한 방울을 추가하고 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
4. 각 1.5mL 갈색 미세 원심분리 튜브에 2mL의 세포 분류 버퍼를 추가하고 450 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 완전히 버리고 펠릿이 포함된 비드를 300μL 세포 분류 버퍼로 재현탁하고 그에 따라 표시된 세포 분류기 튜브로 옮깁니다.

7. 세포 분류기 및 게이팅 전략에서 실행

1. 염색되지 않은 샘플과 보정 튜브를 먼저 적용하고 각 채널의 전압을 조정하여 양극 및 음극 피크를 축의 적절한 위치에 정렬합니다. 보정 설정을 저장하고 다음 샘플에 적용합니다.
2. 세포 분류기에 샘플을 적용합니다. 그림 4에 설명된 대로 게이팅 전략을 설정합니다. 심장 상주 대식세포는 CD45 높은 CD11b 높은 CD64 높은 Ly6C^낮은/int F4/80^높은것으로 확인됩니다. DAPI는 세포 생존율 마커로 사용됩니다.
3. 유세포 분석 차트를 확인하여 관심 있는 세포 집단이 차트에 제대로 표시되는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 각 채널의 전압을 각 차트의 중앙 보기로 조정합니다.
4. 전압 설정이 만족스러우면 분류 절차를 시작하십시오. 분류된 세포 집단을 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM으로 구성된 배양 배지에 수집하고 100μg/mL 스트렙토마이신 및 100U/mL 페니실린이 보충됩니다.

8. 상주 대식세포 배양

1. 분류된 대식세포를 수집한 후, 세포를 즉시 35mm 조직 배양 접시 또는 24웰 플레이트로 옮기거나, 후속 실험을 위해 이들을 직접 사용한다.
2. 선별된 대식세포를 배양하기 위해, 세포를 37°C, 5%_CO2 배양기에서 배양하였다.
3. 48-72 시간마다 배양 배지를 교체하십시오. 부유 죽은 세포는 배지 변화에 의해 쉽게 제거 될 수 있습니다. 후속 실험을 위해 배양 접시의 바닥에 부착된 살아있는 대식세포를 사용하십시오.

결과

우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 실용적인 절차를 설명합니다. 정확한 해부를 확인하기 위해 Masson의 Trichrome 염색 및 면역 형광 HCN4 염색이 수행됩니다 (그림 3)¹². 이 프로토콜을 사용하면 하나의 전체 심장에서 약 60,000 개의 대 식세포를 수집 할 수 있습니다. 도 4는 심장 대식세포를 분류하기 ?...

토론

이 원고에서, 우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 고순도로 심장 상주 대 식세포를 농축하기위한 프로토콜을 기술한다.

대 식세포는 해부학 적 위치와 기능적 표현형에 따라 하위 집단으로 나뉩니다. 그들은 또한 가변 미세 환경 신호에 반응하여 하나의 기능적 표현형에서 다른 기능적 표현형으로 전환 할 수 있습니다¹³. 골수 및 간과 같은 다른 기관과 비교?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories