쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

요약

여기에 제시된 프로토콜은 마우스 심장의 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN) 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 단계별 접근법을 제공한다.

초록

상주 심장 대 식세포는 심장에서 전기 전도를 촉진하는 것으로 입증되었습니다. 생리적 심장 리듬은 동방 결절 (SAN)에서 생성 된 전기 충격에 의해 시작된 다음 방실 결절 (AVN)을 통해 심실로 전달됩니다. 심장 전도 시스템에서 상주 대식세포의 역할을 더 연구하려면 SAN 및 AVN에서 상주 대식세포를 적절하게 분리해야 하지만 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 쥐 심장에서 SAN 및 AVN의 신뢰할 수 있는 미세 해부를 위한 프로토콜을 제공하고 상주 대식세포의 분리 및 배양을 제공합니다.

크리스타 터미널과 상대 정맥의 교차점에 위치한 SAN과 Koch의 삼각형 정점에 위치한 AVN이 모두 식별되고 미세 해부됩니다. 정확한 위치는 Masson의 삼색 염색 및 항 -HCN4로 수행 된 조직의 조직 학적 분석에 의해 확인됩니다.

그런 다음 미세 해부 조직을 효소적으로 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포 유형 특정 표면 마커에 대해 지시된 특정 항체 패널과 함께 배양합니다. 이를 통해 형광 활성화 세포 분류를 통해 서로 다른 세포 집단을 식별, 계수 또는 분리할 수 있습니다. 심장 상주 대식세포를 심근의 다른 면역 세포, 특히 모집된 단핵구 유래 대식세포와 구별하기 위해서는 섬세하게 고안된 게이팅 전략이 필요합니다. 첫째, 림프 계통 세포를 검출하고 추가 분석에서 제외합니다. 이어서, 골수성 세포는 CD45 및 CD11b 둘 다의 높은 발현 및 Ly6C의 낮은 발현에 의해 결정되는 상주 대식세포로 확인된다. 세포 분류를 통해 분리된 심장 대식세포를 추가 조사를 위해 며칠 동안 시험관내에서 배양할 수 있습니다. 따라서 우리는 심장 전도 시스템 내에 위치한 심장 상주 대 식세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 SAN 및 AVN의 미세 해부 및 소화의 함정에 대해 논의하고 형광 활성화 세포 분류를 통해 심장 대 식세포를 안정적으로 식별, 계수 및 분류하는 게이팅 전략을 제공합니다.

서문

동방 결절 (SAN)은 생리 학적으로 전기 충격을 시작하므로 심장의 주요 맥박 조정기입니다. 방실 결절 (AVN)은 심방에서 심실로 전기 충격을 전달하고 보조 심박 조율기¹로도 작용합니다. 일반적으로, 전기 충격의 생성 및 전도는 SAN/AVN 영역의 상주 대식세포를 포함하는 다양한 인자²에 의해 조절될 수 있는 복잡한 과정이다. Hulsmans et al.의 최근 연구는 AVN이 풍부하고 꾸준한 심장 박동을 유지하는 데 핵심 역할을 하는 심장 상주 대식세포의 특정 집단을^{보여줍니다3.} 그들은 대 식세포가 심근 세포에 전기적으로 결합되어 결합 된 심근 세포의 전기적 특성을 변화시킬 수 있음을 발견했습니다. 저자들은 또한 대식세포와 인터리빙하는 이러한 전도성 세포가 SAN과 같은 심장 전도 시스템의 다른 구성 요소에도 존재한다는 점에 주목합니다.

현재, 상주 심장 대 식세포의 표현형이 심장 영역마다 다른지 여부는 완전히 알려져 있지 않습니다. 그러나, 조직 미세 환경이 조직 대 식세포의 전사 및 증식 재생에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다⁴. 또한, 심근세포 표현형이 영역마다 ....

프로토콜

동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨의 바이에른 정부의 승인을 받았습니다. C57BL6/J 마우스를 상업적으로 입수하였다.

1. 준비

1. 세포 분류 완충액(표 1)을 준비하고 4°C에서 보관한다.
   참고: 전체 실험 절차 동안 세포 분류 버퍼는 항상 얼음 위에 있어야 합니다.
2. 콜라게나제의 활성이 실온에서 수 시간 동안만 검출될 수 있었던 것처럼 소화 직전에 소화 완충액(표 1)을 준비하였다.
3. 해부 접시¹⁰의 준비에 대해서는 이전에 발표 된 프로토콜을 참조하십시오. 간단히 말해서 30mL의 아가로스 겔(3%-4%)을 직경 100mm 페트리 접시에 넣고 실온에서 식힙니다.

2. 동물 희생 및 심장 절제

1. 마우스를 이소플루란 기화기로 연결된 배양 챔버에 넣고 5% 이소플루란/95% 산소로 플러싱하여 이소플루란으로 마취합니다.
2. 진통제를 위해 펜타닐을 주사 한 후 흉곽을 열고 5-10mL의 얼음처럼 차가운 1....

결과

우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 심장 상주 대 식세포를 분리하기위한 실용적인 절차를 설명합니다. 정확한 해부를 확인하기 위해 Masson의 Trichrome 염색 및 면역 형광 HCN4 염색이 수행됩니다 (그림 3)¹². 이 프로토콜을 사용하면 하나의 전체 심장에서 약 60,000 개의 대 식세포를 수집 할 수 있습니다. 도 4는 심장 대식세포를 분류하기 ?.......

토론

이 원고에서, 우리는 특히 SAN 및 AVN 영역으로부터 고순도로 심장 상주 대 식세포를 농축하기위한 프로토콜을 기술한다.

대 식세포는 해부학 적 위치와 기능적 표현형에 따라 하위 집단으로 나뉩니다. 그들은 또한 가변 미세 환경 신호에 반응하여 하나의 기능적 표현형에서 다른 기능적 표현형으로 전환 할 수 있습니다¹³. 골수 및 간과 같은 다른 기관과 비교?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories