Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

Riepilogo

Il protocollo qui presentato fornisce un approccio passo-passo per l'isolamento dei macrofagi residenti cardiaci dalla regione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) dei cuori di topo.

Abstract

È stato dimostrato che i macrofagi cardiaci residenti facilitano la conduzione elettrica nel cuore. Il ritmo cardiaco fisiologico è iniziato da impulsi elettrici generati nel nodo senoatriale (SAN) e quindi condotto ai ventricoli tramite nodo atrioventricolare (AVN). Per studiare ulteriormente il ruolo dei macrofagi residenti nel sistema di conduzione cardiaca, è necessario un adeguato isolamento dei macrofagi residenti da SAN e AVN, ma rimane impegnativo. Qui, forniamo un protocollo per la microdissezione affidabile di SAN e AVN nei cuori murini seguita dall'isolamento e dalla coltura dei macrofagi residenti.

Entrambi, SAN che si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore, e AVN che si trova all'apice del triangolo di Koch, sono identificati e microsezionati. La corretta localizzazione è confermata dall'analisi istologica del tessuto eseguita con la colorazione tricromica di Masson e dall'anti-HCN4.

I tessuti microdissezionati vengono quindi digeriti enzimaticamente per ottenere sospensioni monocellulari seguite dall'incubazione con uno specifico pannello di anticorpi diretti contro marcatori di superficie specifici del tipo cellulare. Ciò consente di identificare, contare o isolare diverse popolazioni cellulari mediante selezione cellulare attivata fluorescente. Per differenziare i macrofagi residenti cardiaci da altre cellule immunitarie nel miocardio, in particolare i macrofagi derivati dai monociti reclutati, è necessaria una delicata strategia di gating ideata. In primo luogo, le cellule della linea linfoide vengono rilevate ed escluse da ulteriori analisi. Quindi, le cellule mieloidi sono identificate con macrofagi residenti determinati dall'alta espressione di CD45 e CD11b e dalla bassa espressione di Ly6C. Con la selezione cellulare, i macrofagi cardiaci isolati possono quindi essere coltivati in vitro per diversi giorni per ulteriori indagini. Descriviamo quindi un protocollo per isolare i macrofagi residenti cardiaci situati all'interno del sistema di conduzione cardiaca. Discutiamo le insidie nella microdissezione e nella digestione di SAN e AVN e forniamo una strategia di gating per identificare, contare e ordinare in modo affidabile i macrofagi cardiaci mediante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Introduzione

Il nodo senoatriale (SAN) avvia fisiologicamente l'impulso elettrico ed è, quindi, il pacemaker primario del cuore. Il nodo atrioventricolare (AVN) conduce l'impulso elettrico dagli atri ai ventricoli e funge anche da pacemaker sussidiario¹. In generale, la generazione e la conduzione di impulsi elettrici è un processo complesso che può essere modulato da vari fattori², inclusi i macrofagi residenti nelle regioni SAN / AVN. Un recente studio di Hulsmans et al. dimostra una popolazione specifica di macrofagi residenti cardiaci che sono arricchiti nell'AVN e funzionano come attori chiave nel mantenere un battito cardiaco costante³. Hanno scoperto che i macrofagi sono accoppiati elettricamente ai cardiomiociti e potrebbero cambiare le proprietà elettriche dei cardiomiociti accoppiati. Gli autori osservano inoltre che tali cellule conduttrici che si intercedono con i macrofagi sono presenti anche in altri componenti del sistema di conduzione cardiaca, come il SAN.

Attualmente, non è completamente noto se il fenotipo dei macrofagi cardiaci residenti differisca tra le regioni cardiache. Tuttavia, è stato dimostrato che il microambiente tissutale può influenzare la trascrizione e il rinnovamento proliferativo dei macrofagi tissutali⁴. Inoltre, poiché è stato dimostrato che il fenotipo dei cardiomiociti è diverso tra le regioni, gli effetti funzionali dei macrofagi sui cardiomiociti possono anche essere specifici per regione, anche se il fenotipo macrofagico stesso può essere lo stesso. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su specifiche regioni cardiache.

Studi recenti hanno dimostrato che, allo stato stazionario, i macrofagi residenti nei tessuti si stabiliscono prenatale, insorgono indipendentemente dall'ematopoiesi definitiva e persistono nell'età adulta⁵. Tuttavia, dopo deplezione dei macrofagi o durante l'infiammazione cardiaca, gli^himonociti Ly6c contribuiscono a ricostituire la popolazione di macrofagi cardiaci⁶. Gli studi che coinvolgono il tracciamento del lignaggio genetico, la parabiosi, la mappatura del destino e il tracciamento cellulare hanno mostrato la coesistenza di una varietà di popolazioni di macrofagi residenti nei tessuti in organi e tessuti e, inoltre, un diverso comportamento cellulare dei sottogruppi di macrofagi che sono potenzialmente associati alla loro ontogenesi ^7,8,9.

La caratterizzazione dei macrofagi cardiaci residenti ha beneficiato dell'uso della selezione delle cellule attivate magnetiche (MACS) e della selezione delle cellule attivate fluorescenti. Questi metodi sono particolarmente utili per isolare specifiche popolazioni cellulari da più frazioni di tessuto etichettandole con i loro marcatori di superficie cellulare. Ciò non solo porta ad una maggiore purezza del tipo di cellula immunitaria isolata, ma consente anche l'analisi fenotipica. Qui, presentiamo un protocollo che include cellule rivestite di perline magnetiche seguite da selezione cellulare attivata fluorescente per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente isolati dalla regione SAN e AVN.

Per esplorare le caratteristiche dei macrofagi residenti cardiaci nel sistema di conduzione e la loro funzione per la conduzione cardiaca e l'aritmogenesi, la localizzazione e la dissezione precise di SAN e AVN sono fondamentali. Per la microdissezione di SAN e AVN, vengono utilizzati punti di riferimento anatomici per l'identificazione della regione¹⁰. In breve, SAN si trova all'incrocio della vena cava superiore e dell'atrio destro. AVN si trova all'interno del triangolo di Koch, che è delimitato anteriormente dal foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro¹¹. Forniamo anche un'accurata procedura di microdissezione di SAN e AVN nei topi che è confermata dall'istologia e dalla colorazione con immunofluorescenza.

I macrofagi residenti isolati potrebbero essere utilizzati per ulteriori esperimenti come il sequenziamento dell'RNA o potrebbero essere recuperati e coltivati per più di due settimane consentendo vari esperimenti in vitro. Pertanto, il nostro protocollo descrive una procedura di grande valore per l'immuno-ritmologo. La Tabella 1 mostra la composizione di tutte le soluzioni necessarie, la Figura 1 mostra i punti di riferimento della microdissezione per SAN e AVN. La Figura 2 illustra schematicamente la localizzazione di SAN e AVN. La Figura 3 mostra la colorazione istologica di SAN e AVN (colorazione tricromatica e immunofluorescenza di Masson). La Figura 4 mostra una strategia di gating passo-passo per isolare i macrofagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Protocollo

La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania. I topi C57BL6/J sono stati ottenuti commercialmente.

1. Preparativi

1. Preparare il buffer di selezione delle celle (Tabella 1) e conservare a 4 °C.
   NOTA: Durante l'intera procedura sperimentale, il buffer di selezione delle cellule deve essere sempre congelato.
2. Preparare il tampone di digestione (Tabella 1) poco prima della digestione poiché l'attività della collagenasi potrebbe essere rilevata solo per poche ore a temperatura ambiente.
3. Fare riferimento al protocollo precedentemente pubblicato per la preparazione del piatto di dissezione¹⁰. In breve, aggiungere 30 ml di gel di agarosio (3% -4%) in una capsula di Petri di 100 mm di diametro e raffreddare a temperatura ambiente.

2. Sacrificio animale e asportazione del cuore

1. Anestetizzare il topo con isoflurano mettendolo in una camera di incubazione collegata con un vaporizzatore di isoflurano e lavato con isoflurano al 5% / 95% di ossigeno.
2. Dopo l'iniezione di fentanil per l'analgesia, aprire la gabbia toracica e perfondere il cuore iniettando 5-10 ml di 1x PBS ghiacciato direttamente nel ventricolo sinistro (LV). Estrarre il cuore di topo e metterlo sul piatto di dissezione. I dettagli sperimentali sono stati descritti in dettaglio in precedenza¹⁰.

3. Microdissezione di SAN e AVN

1. Dopo aver isolato il cuore, eseguire le seguenti procedure di microdissezione nel piatto di dissezione con 1x PBS ghiacciato al microscopio da dissezione.
2. Utilizzare i punti di riferimento anatomici cardiaci, cioè aorta, arteria polmonare, seno coronarico, ventricolo sinistro / destro, ecc. per determinare la sinistra/destra (sinistra: LV; destra: RV) e anteriore/posteriore (anteriore: aorta; posteriore: seno coronarico) del cuore. Dopo aver determinato l'orientamento, girare intorno al cuore con la parte anteriore di esso nella parte inferiore del piatto (per esporre le grandi vene che si trovano posteriormente).
3. Microdissezione di SAN
   NOTA: la microdissezione della SAN è stata precedentemente descritta¹⁰. Il processo è descritto in breve di seguito.
   1. Esporre la regione inter-cavale fissando le appendici atriali destre (RAA) e il tessuto adiacente alla vena cava superiore (SVC) e alla vena cava inferiore (IVC) sul piatto di microdissezione usando perni di insetti.
   2. Tagliare il cuore lungo il setto interatriale parallelo alla crista terminalis (CT) per separare la regione inter-cavale e ottenere il campione SAN (Figura 1A, Figura 2A). Mettere il campione in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 mL su ghiaccio.
4. Microdissezione di AVN
   1. Dopo la raccolta del campione SAN, assicurarsi che il RAA e parti dell'atrio destro (RA) siano già stati tagliati lasciando solo il setto interatriale (IAS) e il setto interventricolare (IVS).
   2. Appuntare le parti rimanenti del cuore attraverso il tessuto adiacente alla IAS e all'IVS usando perni di insetto per rendere il lato atriale destro della IAS rivolto verso l'alto.
   3. Guarda l'atrio destro sulla superficie endocardica per il triangolo di Koch. Sarà delimitato anteriormente dalla linea cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide (TV) e posteriormente dal tendine di Todaro. L'orifizio del seno coronarico è osservato alla base. (Figura 1B, Figura 2B).
   4. Tagliare il triangolo di Koch, che contiene l'AVN, e metterlo direttamente in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 ml sul ghiaccio.

4. Digestione

1. Preparare il tampone di digestione (Tabella 1) poco prima dell'uso.
2. Tritare bene il tessuto SAN e AVN con bisturi.
   NOTA: Tritare bene il tessuto aumenterà l'efficienza della digestione e aiuterà a ottenere una buona sospensione cellulare per la selezione. Poiché i campioni SAN e AVN sono piuttosto piccoli, si consiglia di tritare il tessuto direttamente all'interno della provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ridurre la perdita di campione.
3. Aggiungere 500 μL di tampone digestivo per campione e lavare tutto il tessuto tritato dalla parete della provetta da 1,5 mL di microcentrifuga. Il pipettaggio delicato aiuta a digerire il campione.
4. Omogeneizzare il tubo su una macchina a vortice (impostazioni: 37 °C, 750 rpm per 1 h).
5. Dopo la digestione, trasferire la sospensione tissutale in una provetta da centrifuga fresca da 15 ml passando attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Risciacquare il filtro cellulare con altri 5 ml di tampone di selezione cellulare per interrompere la digestione.
6. Centrifugare il tubo da 15 mL a 350 x g per 7 minuti a 4 °C. Quindi rimuovere completamente il surnatante usando la pipetta. Risospendere il pellet cellulare con tampone di selezione cellulare da 90 μL.
   NOTA: Prima della separazione magnetica, pipettare delicatamente la sospensione cellulare alcune volte o passare attraverso un filtro cellulare da 30 μm per rimuovere i grumi cellulari, se necessario, per ottenere una sospensione a cella singola per prestazioni ottimali di arricchimento magnetico di popolazioni cellulari interessanti.

5. Arricchimento magnetico di CD45 e colorazione del campione

NOTA: Per isolare i macrofagi cardiaci con elevata efficienza di selezione, l'esclusione di cellule indesiderate inclusi i linfociti è stata eseguita con microsfere CD45 secondo il protocollo del produttore. Sulla base del pannello di selezione, i macrofagi residenti cardiaci sono stati identificati come CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6C^basso / int F4^{/ 80 alto}.

1. Aggiungere 10 μL di microsfere CD45 per 10⁷ cellule totali alla sospensione cellulare nella provetta da centrifuga da 15 ml. Mescolare bene i campioni e incubarli per 15 minuti a 4 °C.
   NOTA: Il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro deve essere eseguito brevemente per assicurarsi che ogni tubo contenga non più di 10⁷ cellule totali. Quando si lavora con numeri di celle più elevati, il volume delle sfere magnetiche deve essere aumentato.
2. Preparare la miscela anticorpale diluendo i seguenti anticorpi nel tampone di selezione cellulare (diluizione 1:100 per ciascun anticorpo): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI verrà aggiunto in seguito alla colorazione per discriminazione vivi/morti.
3. Dopo 15 minuti di incubazione magnetica a sfere, aggiungere 100 μL di miscela di anticorpi direttamente nella sospensione cellulare nel tubo da 15 mL (quindi la concentrazione finale di tutti gli anticorpi è 1:200) e incubare per 20 minuti a 4 °C.
4. Dopo 20 minuti di incubazione degli anticorpi, lavare la sospensione cellulare aggiungendo 1-2 ml di tampone di selezione cellulare per 10⁷ cellule e centrifugare a 350 x g per 10 minuti. Rimuovere completamente il surnatante mediante pipettaggio.
5. Risospendere fino a 10⁸ celle in 500 μL di buffer di selezione cellulare.
   NOTA: il numero massimo di celle per la separazione magnetica deve essere determinato in base al protocollo del produttore.
6. Preparare il set di separazione magnetica.
   1. Fissare la colonna magnetica a un separatore magnetico adatto e posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna magnetica.
   2. Preparare le colonne magnetiche risciacquando con tampone di selezione cellulare: aggiungere 500 μL di tampone di selezione cellulare nella parte superiore della colonna e lasciare passare il tampone.
7. Applicare immediatamente la sospensione delle celle sulla colonna mentre il buffer di ordinamento delle celle è in transito.
   NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna. Secondo il protocollo del produttore, sebbene il tempo di riempimento della colonna possa cambiare dalle condizioni di conservazione, non ha alcuna influenza sulla qualità della separazione.
8. Lavare la colonna con 3 tampone di selezione delle celle da 500 μL. Il flow-through nel passaggio 5.7 e nel passaggio 5.8 contiene celle non etichettate, che possono essere scartate se non sono necessari ulteriori esperimenti.
   NOTA: aggiungere immediatamente il buffer di ordinamento delle celle quando il serbatoio della colonna è quasi vuoto.
9. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta.
10. Aggiungere 1 mL di buffer di ordinamento delle celle nella colonna. Lavare immediatamente la colonna applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna. Il flow-through contiene le celle marcate magneticamente.
11. Aggiungere la soluzione DAPI in tutte le sospensioni cellulari raccolte con etichetta magnetica poco prima di eseguirle sul selezionatore cellulare. Regolare la concentrazione finale di DAPI a 0,3-0,5 μg/ml.
12. Eseguire analisi FACS.

6. Campioni di risarcimento

1. Preparare 6 provette da microcentrifuga marrone da 1,5 mL etichettate rispettivamente come "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" e "DAPI" per proteggere gli anticorpi dalla luce. Preparare un altro tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato come "non macchiato".
   NOTA: Questo potrebbe essere fatto contemporaneamente all'incubazione della sospensione cellulare con le microsfere e gli anticorpi. Il campione non colorato potrebbe essere il tessuto cardiomiocitario raccolto casualmente dal tessuto cardiaco risparmiato e trattato anche secondo la fase 4.
2. Diluire ogni singolo anticorpo coniugato a fluorescenza con tampone di selezione cellulare in 1:50 nelle provette di microcentrifuga marrone da 1,5 mL contrassegnate di conseguenza.
3. Aggiungere una goccia di soluzione di perline di compensazione e incubare per 20 minuti a 4 °C.
4. Aggiungere 2 ml di tampone di selezione cellulare in ogni provetta da microcentrifuga marrone da 1,5 ml e centrifugare a 450 x g per 5 minuti. Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet contenente il cordone con tampone di selezione cellulare da 300 μL e trasferirli in provette selezionatrici anch'esse contrassegnate di conseguenza.

7. Esecuzione sul selezionatore di celle e strategia di gating

1. Applicare prima il campione non colorato e i tubi di compensazione e regolare le tensioni di ciascun canale per allineare sia il picco positivo che quello negativo alla posizione corretta dell'asse. Salvare le impostazioni di compensazione e applicarle ai seguenti esempi.
2. Applicare i campioni sullo smistatore di cellule. Impostare la strategia di gating come descritto nella Figura 4. I macrofagi residenti cardiaci sono identificati come CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6C^{basso / int} F4^/ 80^alto. DAPI è usato come marcatore di vitalità cellulare.
3. Controllare i grafici di citometria a flusso per confermare che la popolazione cellulare di interesse sia correttamente mostrata sui grafici. In caso contrario, regolare la tensione di ciascun canale in base alla vista centrale di ciascun grafico.
4. Se le impostazioni di tensione sono soddisfacenti, avviare la procedura di ordinamento. Raccogliere la popolazione cellulare ordinata in terreno di coltura composto da DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino, integrato con 100 μg / mL di streptomicina e 100 U / mL di penicillina.

8. Cultura dei macrofagi residenti

1. Dopo aver raccolto i macrofagi ordinati, trasferire immediatamente le cellule in piastre di coltura tissutale da 35 mm o in una piastra a 24 pozzetti o utilizzarle direttamente per esperimenti successivi.
2. Per coltivare macrofagi selezionati, incubare le cellule a 37 °C, incubatore al 5% di CO₂ .
3. Cambiare il terreno di coltura ogni 48-72 ore. Le cellule morte galleggianti possono essere facilmente rimosse con un cambiamento medio. Utilizzare macrofagi vivi attaccati al fondo del piatto di coltura per esperimenti successivi.

Risultati

Descriviamo una procedura pratica per l'isolamento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalla regione SAN e AVN. Per confermare una corretta dissezione, viene eseguita la colorazione Trichrome di Masson e la colorazione immunofluorescente HCN4 (Figura 3)¹². Con questo protocollo, potremmo raccogliere circa 60.000 macrofagi da un cuore intero. La Figura 4 mostra la strategia di gating per l'ordinamento dei macrofagi cardiaci. I m...

Discussione

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalle regioni SAN e AVN ad alta purezza.

I macrofagi sono divisi in sottopopolazioni in base alla loro posizione anatomica e al fenotipo funzionale. Possono anche passare da un fenotipo funzionale all'altro in risposta a segnali microambientali variabili¹³. Rispetto ad altri organi come il midollo osseo e il fegato, il tessuto cardiaco contiene una percent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories