Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen schrittweisen Ansatz für die Isolierung von kardialen residenten Makrophagen aus der Region des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) von Mäuseherzen.

Zusammenfassung

Es wurde gezeigt, dass residente Herzmakrophagen die elektrische Leitung im Herzen erleichtern. Der physiologische Herzrhythmus wird durch elektrische Impulse initiiert, die im Sinusknoten (SAN) erzeugt und dann über den atrioventrikulären Knoten (AVN) zu den Ventrikeln geleitet werden. Um die Rolle residenter Makrophagen im Herzleitungssystem weiter zu untersuchen, ist eine ordnungsgemäße Isolierung der residenten Makrophagen aus SAN und AVN erforderlich, bleibt jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die zuverlässige Mikrodissektion des SAN und AVN in murinen Herzen zur Verfügung, gefolgt von der Isolierung und Kultur residenter Makrophagen.

Sowohl SAN, das sich an der Kreuzung des Crista-Terminalis mit der oberen Hohlvene befindet, als auch AVN, das sich an der Spitze des Koch-Dreiecks befindet, werden identifiziert und mikroseziert. Die korrekte Lokalisation wird durch histologische Analyse des Gewebes bestätigt, die mit Massons Trichrom-Färbung und durch Anti-HCN4 durchgeführt wird.

Mikrosezierte Gewebe werden dann enzymatisch verdaut, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, gefolgt von der Inkubation mit einem spezifischen Panel von Antikörpern, die gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker gerichtet sind. Dies ermöglicht es, verschiedene Zellpopulationen durch fluoreszierend aktivierte Zellsortierung zu identifizieren, zu zählen oder zu isolieren. Um kardiale residente Makrophagen von anderen Immunzellen im Myokard zu unterscheiden, insbesondere von rekrutierten Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, ist eine sorgfältig entwickelte Gating-Strategie erforderlich. Zunächst werden lymphatische Linienzellen nachgewiesen und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Dann werden myeloische Zellen mit residenten Makrophagen identifiziert, die durch eine hohe Expression von CD45 und CD11b und eine niedrige Expression von Ly6C bestimmt werden. Mit der Zellsortierung können dann isolierte Herzmakrophagen über mehrere Tage in vitro kultiviert werden, um weitere Untersuchungen durchzuführen. Wir beschreiben daher ein Protokoll zur Isolierung kardialer Makrophagen, die sich innerhalb des Herzleitungssystems befinden. Wir diskutieren Fallstricke bei der Mikrozerlegung und Verdauung von SAN und AVN und bieten eine Gating-Strategie zur zuverlässigen Identifizierung, Zählung und Sortierung von Herzmakrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.

Einleitung

Der Sinusknoten (SAN) initiiert physiologisch den elektrischen Impuls und ist somit der primäre Schrittmacher des Herzens. Der atrioventrikuläre Knoten (AVN) leitet den elektrischen Impuls von den Vorhöfen zu den Ventrikeln und fungiert auch als Hilfsschrittmacher¹. Im Allgemeinen ist die Erzeugung und Leitung elektrischer Impulse ein komplexer Prozess, der durch verschiedene Faktoren² moduliert werden kann, einschließlich residenter Makrophagen in SAN/AVN-Regionen. Eine aktuelle Studie von Hulsmans et al. zeigt eine spezifische Population von kardialen residenten Makrophagen, die im AVN angereichert sind und als Schlüsselakteure bei der Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Herzschlags fungieren³. Sie fanden heraus, dass Makrophagen elektrisch an die Kardiomyozyten gekoppelt sind und die elektrischen Eigenschaften gekoppelter Kardiomyozyten verändern könnten. Die Autoren stellen auch fest, dass solche leitenden Zellen, die mit Makrophagen verschachtelt sind, auch in anderen Komponenten des Herzleitungssystems, wie dem SAN, vorhanden sind.

Derzeit ist nicht vollständig bekannt, ob sich der Phänotyp der residenten Herzmakrophagen zwischen den Herzregionen unterscheidet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Mikroumgebung des Gewebes die Transkription und proliferative Erneuerung von Gewebemakrophagen beeinflussen kann⁴. Da der Kardiomyozyten-Phänotyp zwischen den Regionen unterschiedlich ist, können die funktionellen Wirkungen von Makrophagen auf Kardiomyozyten auch regionsspezifisch sein, auch wenn der Makrophagen-Phänotyp selbst derselbe sein kann. Daher sind weitere Studien zu bestimmten Herzregionen erforderlich.

Neuere Studien haben gezeigt, dass die geweberesidenten Makrophagen im Steady State pränatal etabliert sind, unabhängig von der definitiven Hämatopoese entstehen und bis ins Erwachsenenalter bestehen^{bleiben 5}. Nach Makrophagen-Depletion oder während einer Herzentzündung tragen Ly6c-Hi-Monozyten jedoch zur Auffüllung der kardialen Makrophagenpopulation bei⁶. Studien zur genetischen Abstammungsverfolgung, Parabiose, Schicksalskartierung und Zellverfolgung zeigten die Koexistenz einer Vielzahl von geweberesidenten Makrophagenpopulationen in Organen und Geweben sowie ein unterschiedliches zelluläres Verhalten von Makrophagen-Untergruppen, die möglicherweise mit ihrer Ontogenese assoziiert sind ^7,8,9.

Die Charakterisierung residenter kardialer Makrophagen hat von der Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) und fluoreszierend aktivierter Zellsortierung profitiert. Diese Methoden sind besonders nützlich, um bestimmte Zellpopulationen aus mehreren Gewebefraktionen zu isolieren, indem sie mit ihren Zelloberflächenmarkern markiert werden. Dies führt nicht nur zu einer höheren Reinheit des isolierten Immunzelltyps, sondern ermöglicht auch eine phänotypische Analyse. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit magnetisch perlenbeschichteten Zellen, gefolgt von fluoreszierend aktivierter Zellsortierung zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen, die spezifisch aus der SAN- und AVN-Region isoliert wurden.

Um die Eigenschaften von kardialen residenten Makrophagen im Leitungssystem und ihre Funktion für die Herzleitung und Arrhythmogenese zu untersuchen, ist eine präzise Lokalisierung und Dissektion von SAN und AVN von entscheidender Bedeutung. Für die Mikrodissektion von SAN und AVN werden anatomische Landmarken für die Regionsidentifikation¹⁰ verwendet. Kurz gesagt, SAN befindet sich an der Kreuzung der oberen Hohlvene und des rechten Vorhofs. AVN befindet sich im Dreieck von Koch, das anterior durch das Septumblatt der Trikuspidalklappe und posterior durch die Sehne von Todaro¹¹ begrenzt wird. Wir bieten auch ein genaues Mikrodissektionsverfahren von SAN und AVN in Mäusen, das durch Histologie und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt wird.

Isolierte residente Makrophagen könnten für weitere Experimente wie RNA-Sequenzierung verwendet oder für mehr als zwei Wochen geborgen und kultiviert werden, was verschiedene In-vitro-Experimente ermöglicht. Daher beschreibt unser Protokoll ein sehr wertvolles Verfahren für den Immunrhythmologen. Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung aller benötigten Lösungen, Abbildung 1 zeigt die Mikrodissektions-Orientierungspunkte für SAN und AVN. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der SAN- und AVN-Lokalisierung. Abbildung 3 zeigt die histologische Färbung von SAN und AVN (Masson-Trichrom- und Immunfluoreszenzfärbung). Abbildung 4 zeigt eine Schritt-für-Schritt-Gating-Strategie zur Isolierung kardialresidenter Makrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.

Protokoll

Die Tierpflege und alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierpflege- und Ethikkommission der Universität München durchgeführt und alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Bayerischen Regierung, München, Deutschland, genehmigt. C57BL6/J-Mäuse wurden kommerziell gewonnen.

1. Vorbereitungen

1. Zellsortierpuffer vorbereiten (Tabelle 1) und bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Während des gesamten experimentellen Verfahrens sollte der Zellsortierpuffer immer auf Eis liegen.
2. Verdauungspuffer (Tabelle 1) kurz vor der Verdauung vorbereiten, da die Aktivität der Kollagenase nur wenige Stunden bei Raumtemperatur nachgewiesen werden konnte.
3. Für die Zubereitung der Präparierschale¹⁰ beziehen Sie sich auf das zuvor veröffentlichte Protokoll. Kurz gesagt, geben Sie 30 ml Agarosegel (3% -4%) in eine Petrischale mit 100 mm Durchmesser und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur ab.

2. Tieropfer und Herzexzision

1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran, indem Sie sie in eine Inkubationskammer geben, die mit einem Isofluran-Vaporizer verbunden ist und mit 5% Isofluran / 95% Sauerstoff gespült wird.
2. Nach der Injektion von Fentanyl zur Analgesie den Brustkorb öffnen und das Herz durchbluten, indem Sie 5-10 ml eiskaltes 1x PBS direkt in den linken Ventrikel (LV) injizieren. Extrahieren Sie das Herz der Mäuse und legen Sie es auf die Sezierschale. Experimentelle Details wurden zuvor ausführlich beschrieben¹⁰.

3. Mikrodissektion von SAN und AVN

1. Nach der Isolierung des Herzens führen Sie die folgenden Mikrodissektionsverfahren in der Dissektionsschale mit eiskaltem 1x PBS unter dem Seziermikroskop durch.
2. Verwenden Sie die herzanatomischen Orientierungspunkte, d. H. Aorta, Lungenarterie, Koronarsinus, linker / rechter Ventrikel usw. zur Bestimmung des links/rechten (links: LV; rechts: RV) und anterior/posterior (anterior: Aorta; posterior: Koronarsinus) des Herzens. Nachdem die Orientierung bestimmt ist, drehen Sie sich um das Herz mit der Vorderseite am Boden der Schale (um die großen Venen freizulegen, die sich nach hinten befinden).
3. Mikrodissektion von SAN
   HINWEIS: Die Mikrodissektion des SAN wurde bereits beschrieben¹⁰. Der Prozess wird im Folgenden kurz beschrieben.
   1. Belichten Sie die Region zwischen den Kavalen, indem Sie die rechten Vorhofanhänge (RAA) und das Gewebe neben der oberen Hohlvene (SVC) und der unteren Hohlvene (IVC) mit Insektenstiften auf die Mikrodissektionsschale stecken.
   2. Schneiden Sie das Herz entlang des interatrialen Septums parallel zur Crista terminalis (CT), um die interkavale Region zu trennen und die SAN-Probe zu erhalten (Abbildung 1A, Abbildung 2A). Legen Sie die Probe in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
4. Mikrodissektion von AVN
   1. Stellen Sie nach der Entnahme der SAN-Probe sicher, dass die RAA und Teile des rechten Vorhofs (RA) bereits abgeschnitten wurden, so dass nur das interatriale Septum (IAS) und das interventrikuläre Septum (IVS) übrig bleiben.
   2. Stecken Sie die verbleibenden Teile des Herzens durch das Gewebe neben IAS und IVS mit Insektenstiften, um die rechte Vorhofseite der IAS nach oben zu zeigen.
   3. Schauen Sie sich den rechten Vorhof auf der Endokardoberfläche für das Dreieck von Koch an. Es wird anterior durch die Scharnierlinie des Septumblattes der Trikuspidalklappe (TV) und posterior durch die Sehne von Todaro begrenzt. Die Öffnung des Koronarsinus wird an der Basis beobachtet. (Abbildung 1B, Abbildung 2B).
   4. Schneiden Sie das Koch-Dreieck, das das AVN enthält, ab und legen Sie es direkt in ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.

4. Verdauung

1. Bereiten Sie den Aufschlusspuffer (Tabelle 1) kurz vor Gebrauch vor.
2. Zerkleinern Sie das SAN- und AVN-Gewebe gut mit Skalpellen.
   HINWEIS: Das Hacken des Gewebes erhöht die Verdauungseffizienz und hilft, eine gute Zellsuspension für die Sortierung zu erhalten. Da die SAN- und AVN-Proben recht klein sind, wird empfohlen, das Gewebe direkt im 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu zerkleinern, um den Probenverlust zu reduzieren.
3. Fügen Sie 500 μL Verdauungspuffer pro Probe hinzu und waschen Sie das gesamte Hackfleischgewebe von der Wand des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens ab. Schonendes Pipettieren hilft bei der Verdauung der Probe.
4. Homogenisieren Sie das Rohr auf einer Wirbelmaschine (Einstellungen: 37 °C, 750 U/min für 1 h).
5. Nach der Verdauung wird die Gewebesuspension durch ein 40-μm-Zellsieb in ein frisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Spülen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 5 ml Zellsortierpuffer, um die Verdauung zu stoppen.
6. Zentrifugieren Sie das 15 ml Röhrchen bei 350 x g für 7 min bei 4 °C. Entfernen Sie dann den Überstand vollständig mit der Pipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 90 μL Zellsortierpuffer.
   HINWEIS: Vor der magnetischen Trennung pipetten Sie die Zellsuspension einige Male vorsichtig oder passieren Sie ein 30-μm-Zellsieb, um bei Bedarf Zellklumpen zu entfernen, um eine Einzelzellsuspension für eine optimale Durchführung der magnetischen Anreicherung interessanter Zellpopulationen zu erhalten.

5. Magnetische Anreicherung von CD45 und Probenfärbung

HINWEIS: Um die Herzmakrophagen mit hoher Sortiereffizienz zu isolieren, wurde der Ausschluss unerwünschter Zellen einschließlich Lymphozyten mit CD45-Mikrokügelchen gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Basierend auf dem Sortierpanel wurden kardiale residente Makrophagen als CD45 hoch CD11b hoch CD64 hoch Ly6C^{niedrig / int} F4/80 ^hochidentifiziert.

1. 10 μL CD45-Mikrokügelchen pro 10⁷ Zellen in die Zellsuspension im 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Die Proben gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die Zellzählung mit einem Hämozytometer sollte kurz durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass jedes Röhrchen nicht mehr als 10⁷ Zellen enthält. Bei der Arbeit mit höheren Zellzahlen muss das Volumen der magnetischen Perlen vergrößert werden.
2. Bereiten Sie die Antikörpermischung vor, indem Sie die folgenden Antikörper im Zellsortierpuffer verdünnen (1:100 Verdünnung für jeden Antikörper): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI wird später zur Färbung für Lebend/Toten-Diskriminierung hinzugefügt.
3. Nach 15 min magnetischer Bead-Inkubation 100 μL Antikörpergemisch direkt in die Zellsuspension im 15-ml-Röhrchen geben (dann beträgt die Endkonzentration aller Antikörper 1:200) und 20 min bei 4 °C inkubieren.
4. Nach 20 min Antikörperinkubation die Zellsuspension waschen, indem Sie 1-2 ml Zellsortierpuffer pro 10⁷ Zellen hinzufügen und bei 350 x g für 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vollständig durch Pipettieren.
5. Resuspendieren Sie bis zu 10⁸ Zellen in 500 μL Zellsortierpuffer.
   HINWEIS: Die maximale Zellzahl für die magnetische Trennung sollte gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt werden.
6. Bereiten Sie das magnetische Trennset vor.
   1. Befestigen Sie die Magnetsäule an einem geeigneten Magnetabscheider und legen Sie ein Sammelrohr unter die Magnetsäule.
   2. Bereiten Sie die Magnetsäulen vor, indem Sie mit dem Zellsortierpuffer spülen: Fügen Sie 500 μL Zellsortierpuffer oben in die Säule und lassen Sie den Puffer passieren.
7. Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf, während der Zellsortierpuffer durchläuft.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen in der Säule. Gemäß dem Herstellungsprotokoll kann sich die Kolonnenfüllzeit zwar aufgrund der Lagerbedingungen ändern, hat jedoch keinen Einfluss auf die Qualität der Trennung.
8. Waschen Sie die Säule mit 3 x 500 μL Zellsortierpuffer. Der Durchfluss in Schritt 5.7 und Schritt 5.8 enthält unmarkierte Zellen, die verworfen werden können, wenn kein weiteres Experiment erforderlich ist.
   HINWEIS: Fügen Sie den Zellsortierpuffer sofort hinzu, wenn das Spaltenreservoir fast leer ist.
9. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider, und legen Sie sie auf ein neues Sammelrohr.
10. Fügen Sie der Spalte 1 ml Zellsortierpuffer hinzu. Spülen Sie die Säule sofort, indem Sie den mitgelieferten Kolben fest auftragen. Der Durchfluss enthält die magnetisch markierten Zellen.
11. Fügen Sie DAPI-Lösung in alle gesammelten magnetisch markierten Zellsuspensionen hinzu, kurz bevor sie auf dem Zellsortierer ausgeführt werden. Stellen Sie die Endkonzentration von DAPI auf 0,3-0,5 μg/ml ein.
12. Führen Sie eine FACS-Analyse durch.

6. Muster zur Entschädigung

1. Bereiten Sie 6 braune 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die als "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" und "DAPI" gekennzeichnet sind, um Antikörper vor Licht zu schützen. Bereiten Sie ein weiteres 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, das als "ungefärbt" gekennzeichnet ist.
   HINWEIS: Dies könnte gleichzeitig mit der Inkubation der Zellsuspension mit den Mikrokügelchen und Antikörpern erfolgen. Die ungefärbte Probe könnte das Kardiomyozytengewebe sein, das zufällig aus dem geschonten Herzgewebe entnommen und ebenfalls gemäß Schritt 4 behandelt wird.
2. Verdünnen Sie jeden einzelnen fluoreszenzkonjugierten Antikörper mit Zellsortierpuffer in 1:50 in den 1,5 ml braunen Mikrozentrifugenröhrchen, die entsprechend gekennzeichnet sind.
3. Einen Tropfen Kompensationsperlenlösung zugeben und 20 min bei 4 °C inkubieren.
4. 2 mL Zellsortierpuffer in jedes 1,5 ml braune Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 450 x g für 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das perlenhaltige Pellet mit 300 μL Zellsortierpuffer und geben Sie sie in Zellsortierröhrchen, die ebenfalls entsprechend gekennzeichnet sind.

7. Ausführen auf dem Zellsortierer und Gating-Strategie

1. Wenden Sie zuerst die ungefärbten Proben- und Kompensationsröhrchen an und passen Sie die Spannungen jedes Kanals an, um sowohl den positiven als auch den negativen Peak an der richtigen Position der Achse auszurichten. Speichern Sie die Kompensationseinstellungen, und wenden Sie sie auf die folgenden Beispiele an.
2. Tragen Sie die Proben auf den Zellsortierer auf. Legen Sie die Gating-Strategie wie in Abbildung 4 beschrieben fest. Herzresidente Makrophagen werden als CD45 hoch CD11b hoch CD64 hoch Ly6C^{niedrig / int} F4/80^hochidentifiziert. DAPI wird als Zelllebensfähigkeitsmarker verwendet.
3. Überprüfen Sie die Durchflusszytometrie-Diagramme, um zu bestätigen, dass die interessierende Zellpopulation ordnungsgemäß in den Diagrammen angezeigt wird. Wenn nicht, passen Sie die Spannung jedes Kanals an die Mittelansicht jedes Diagramms an.
4. Wenn die Spannungseinstellungen zufriedenstellend sind, starten Sie den Sortiervorgang. Sammeln Sie die sortierte Zellpopulation in ein Kulturmedium, das aus DMEM besteht, das 10% fötales Rinderserum enthält, ergänzt mit 100 μg / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin.

8. Residente Makrophagenkultur

1. Nach dem Sammeln der sortierten Makrophagen übertragen Sie die Zellen sofort entweder auf 35 mm Gewebekulturschalen oder 24 Well-Platten oder verwenden Sie sie direkt für nachfolgende Experimente.
2. Um sortierte Makrophagen zu kultivieren, inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} .
3. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 48-72 h. Schwebende, tote Zellen können durch Mediumwechsel leicht entfernt werden. Verwenden Sie lebende Makrophagen, die am Boden der Kulturschale befestigt sind, für nachfolgende Experimente.

Ergebnisse

Wir beschreiben ein praktisches Verfahren zur Isolierung kardialer Makrophagen speziell aus der SAN- und AVN-Region. Um eine korrekte Dissektion zu bestätigen, wird Massons Trichromfärbung und immunfluoreszierende HCN4-Färbung durchgeführt (Abbildung 3)¹². Mit diesem Protokoll könnten wir ungefähr 60.000 Makrophagen aus einem ganzen Herzen sammeln. Abbildung 4 zeigt die Gating-Strategie zur Sortierung von Herzmakrophagen. Lebende re...

Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen speziell aus den SAN- und AVN-Regionen in hoher Reinheit.

Makrophagen werden basierend auf ihrer anatomischen Lage und ihrem funktionellen Phänotyp in Subpopulationen unterteilt. Sie können auch von einem funktionellen Phänotyp auf einen anderen als Reaktion auf variable Mikroumgebungssignale umschalten¹³. Im Vergleich zu anderen Organen wie Knochenmark und Leber ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories