בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.

Abstract

מקרופאגים לבביים מקומיים הוכחו כמקלים על ההולכה החשמלית בלב. קצב הלב הפיזיולוגי מופעל על ידי דחפים חשמליים הנוצרים בצומת הסינואטרלי (SAN) ולאחר מכן מוליכים אותם לחדרים דרך צומת אטריובנטריקולרי (AVN). כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של מקרופאגים תושבים במערכת הולכת הלב, יש צורך בבידוד נכון של מקרופאגים תושבים מ-SAN ו-AVN, אך הוא עדיין מאתגר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה אמינה של ה-SAN וה-AVN בלבבות מורין ואחריה הבידוד והתרבות של מקרופאגים מקומיים.

שניהם, SAN אשר ממוקם בצומת של crista terminalis עם הווריד הנבוב העליון, ו AVN אשר ממוקם בקצה המשולש של קוך, מזוהים microdissected. מיקום נכון מאושר על ידי ניתוח היסטולוגי של הרקמה המבוצע עם כתם טריכרום של מסון ועל ידי אנטי HCN4.

לאחר מכן, רקמות מיקרו-דיסקרטיות מתעכלות באופן אנזימטי כדי לקבל תרחיפים של תאים בודדים ולאחר מכן הדגירה עם פאנל מסוים של נוגדנים המכוונים נגד סמני פני שטח ספציפיים מסוג תא. זה מאפשר לזהות, לספור או לבודד אוכלוסיות תאים שונות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כדי להבדיל בין מקרופאגים תושבי לב לבין תאים חיסוניים אחרים בשריר הלב, במיוחד מקרופאגים שמקורם במונוציטים, יש צורך באסטרטגיית גיתור עדינה. ראשית, תאי שושלת לימפואידים מזוהים ואינם נכללים בניתוח נוסף. לאחר מכן, תאים מיאלואידים מזוהים עם מקרופאגים מקומיים הנקבעים על ידי ביטוי גבוה של CD45 ו- CD11b, וביטוי נמוך של Ly6C. באמצעות מיון תאים, ניתן לטפח מקרופאגים לבביים מבודדים במבחנה במשך מספר ימים לצורך חקירה נוספת. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד מקרופאגים תושבי לב הממוקמים בתוך מערכת ההולכה הלבבית. אנו דנים במלכודות במיקרו-דיסקציה ובעיכול SAN ו-AVN, ומספקים אסטרטגיית גידור לזיהוי, ספירה ומיון אמינים של מקרופאגים לבביים על-ידי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה.

Introduction

הצומת הסינואטריאלי (SAN) יוזם פיזיולוגית את הדחף החשמלי ולכן הוא קוצב הלב העיקרי של הלב. הצומת האטריובנטריקולרי (AVN) מוליך את הדחף החשמלי מהאטריה אל החדרים ופועל גם כקוצב לב בת¹. באופן כללי, ייצור והולכה של דחפים חשמליים הוא תהליך מורכב שניתן לווסת על ידי גורמים שונים², כולל מקרופאגים תושבים באזורי SAN/AVN. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Hulsmans et al. מדגים אוכלוסייה ספציפית של מקרופאגים תושבי לב המועשרים ב- AVN ומתפקדים כשחקני מפתח בשמירה על דופק יציב³. הם מצאו כי מקרופאגים מצומדים חשמלית לקרדיומיוציטים ויכולים לשנות את התכונות החשמליות של קרדיומיוציטים מצומדים. המחברים מציינים גם כי תאים מוליכים כאלה המשולבים עם מקרופאגים נמצאים גם ברכיבים אחרים של מערכת ההולכה הלבבית, כגון SAN.

נכון לעכשיו, לא ידוע אם הפנוטיפ של מקרופאגים לבביים תושבים שונה בין אזורי הלב. עם זאת, הוכח כי מיקרו-סביבה של רקמות יכולה להשפיע על שעתוק והתחדשות שגשוג של מקרופאגים רקמתיים⁴. יתר על כן, מאחר שפנוטיפ הקרדיומיוציטים הוכח כשונה בין אזורים, ההשפעות התפקודיות של מקרופאגים על קרדיומיוציטים עשויות להיות גם ספציפיות לאזור, גם אם הפנוטיפ של המקרופאגים עצמו עשוי להיות זהה. לכן, יש צורך במחקרים נוספים על אזורי לב ספציפיים.

מחקרים אחרונים הראו כי במצב יציב, המקרופאגים השוכנים ברקמה נקבעים לפני הלידה, נובעים ללא תלות בהמטופויזה סופית, ונמשכים לבגרות⁵. עם זאת, לאחר דלדול מקרופאגים או במהלך דלקת לב, Ly6c^היי מונוציטים לתרום לחידוש אוכלוסיית מקרופאגים לבביים⁶. מחקרים שכללו מעקב אחר שושלת גנטית, פרביוזה, מיפוי גורלות ומעקב אחר תאים הראו את הדו-קיום של מגוון אוכלוסיות מקרופאגים תושבי רקמות באיברים וברקמות, וכן, התנהגות תאית שונה של תת-קבוצות מקרופאגים שעשויות להיות קשורות לאונטוגניה ^{שלהם 7,8,9.}

האפיון של מקרופאגים לבביים מקומיים נהנה משימוש במיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS) ומיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. שיטות אלה שימושיות במיוחד לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות משברי רקמות מרובים על ידי תיווגם עם סמני פני התא שלהם. זה לא רק מוביל לטוהר גבוה יותר של סוג התא החיסוני המבודד, אלא גם מאפשר ניתוח פנוטיפי. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל תאים מצופים חרוזים מגנטיים ולאחר מכן מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים להעשרת מקרופאגים תושבי לב שבודדו במיוחד מאזור SAN ו- AVN.

כדי לחקור את המאפיינים של מקרופאגים תושבי לב במערכת ההולכה ואת תפקודם עבור הולכה לבבית והפרעות קצב, לוקליזציה מדויקת ודיסקציה של SAN ו- AVN הם קריטיים. עבור מיקרודיסקציה של SAN ו- AVN, ציוני דרך אנטומיים משמשים לזיהוי האזור¹⁰. בקצרה, SAN ממוקם בצומת של הווריד הנבוב העליון והאטריום הימני. AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך, אשר גובל קדמית על ידי עלון מחיצה של שסתום tricuspid, ומאחור על ידי הגיד של Todaro¹¹. אנו מספקים גם הליך מיקרו-דיסקציה מדויק של SAN ו- AVN בעכברים אשר אושר על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.

מקרופאגים מקומיים מבודדים יכולים לשמש לניסויים נוספים כגון ריצוף RNA או שניתן לשחזר ולטפח אותם במשך יותר משבועיים ולאפשר ניסויים שונים במבחנה. לכן, הפרוטוקול שלנו מתאר הליך בעל ערך רב עבור האימונו-ריתמולוג. טבלה 1 מציגה את ההרכב של כל הפתרונות הדרושים, איור 1 מראה את ציוני הדרך של מיקרו-דיסקציה עבור SAN ו-AVN. איור 2 הוא המחשה סכמטית של לוקליזציה של SAN ו-AVN. איור 3 מראה את הכתמים ההיסטולוגיים של SAN ו-AVN (הכתם הטריכרום והאימונופלואורסצנציה של מאסון). איור 4 מראה אסטרטגיית מיון שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה של אוניברסיטת מינכן וכל ההליכים שבוצעו על עכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה. עכברי C57BL6/J הושגו באופן מסחרי.

1. הכנות

1. הכן את מאגר מיון התאים (טבלה 1) ואחסן ב- 4 °C.
   הערה: במהלך כל הליך הניסוי, מאגר מיון התאים צריך להיות תמיד על קרח.
2. הכן את מאגר העיכול (טבלה 1) זמן קצר לפני העיכול, שכן ניתן היה לזהות את פעילות הקולגן רק למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.
3. עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר להכנת צלחת דיסקציה¹⁰. בקיצור, הוסיפו 30 מ"ל של ג'ל אגרוז (3%-4%) לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ והתקררו בטמפרטורת החדר.

2. הקרבת בעלי חיים וכריתת לב

1. הרדמת העכבר עם איזופלורן על ידי הצבתו בתא דגירה המחובר עם מכשיר אידוי איזופלורן ושטף עם 5% איזופלורן / 95% חמצן.
2. לאחר הזרקת פנטניל לשיכוך כאבים, לפתוח את כלוב הצלעות ולהחדיר את הלב על ידי הזרקת 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח 1x ישירות לתוך החדר השמאלי (LV). חלצו את לב העכברים והניחו אותו על צלחת הדיסקציה. פרטי הניסוי תוארו בפירוט בעבר¹⁰.

3. מיקרו-דיסקציה של SAN ו-AVN

1. לאחר בידוד הלב, בצע את הליכי המיקרודיסקציה הבאים בצלחת הדיסקציה עם PBS קר כקרח 1x תחת מיקרוסקופ הניתוח.
2. השתמש בציוני דרך אנטומיים לבביים, כלומר, אבי העורקים, עורק הריאה, הסינוס הכלילי, חדר שמאל/ימין וכו '. כדי לקבוע את השמאלי/ימני (משמאל: LV; מימין: RV) והקדמי/אחורי (קדמי: אבי העורקים; אחורי: סינוס כלילי) של הלב. לאחר קביעת הכיוון, סובבו את הלב עם חזיתו בתחתית המנה (כדי לחשוף את הוורידים הגדולים הממוקמים מאחור).
3. מיקרודיסקציה של SAN
   הערה: מיקרו-דיסקציה של ה-SAN תוארה קודם^{לכן כ-10}. התהליך מתואר בקצרה להלן.
   1. חשוף את האזור הבין-קבלי על ידי הצמדת נספחי הפרוזדורים הימניים (RAA) והרקמה הסמוכה לווריד הנבוב העליון (SVC) ולווריד הנבוב התחתון (IVC) על צלחת המיקרו-דיסקציה באמצעות סיכות חרקים.
   2. חתכו את הלב לאורך המחיצה הבין-פרוזדורית במקביל ל-crista terminalis (CT) כדי להפריד בין האזור הבין-קבלי ולקבל את דגימת ה-SAN (איור 1A, איור 2A). שים את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מ"ל על קרח.
4. מיקרו-דיסקציה של AVN
   1. לאחר איסוף דגימת ה- SAN ודא שה- RAA וחלקים מהאטריום הימני (RA) כבר נחתכו והותירו רק את המחיצה הבין-חדרית (IAS) ואת המחיצה הבין-חדרית (IVS).
   2. הצמד את החלקים הנותרים של הלב דרך הרקמה הסמוכה ל-IAS ול-IVS באמצעות סיכות חרקים כדי לגרום לצד הפרוזדורים הימני של ה-IAS לפנות כלפי מעלה.
   3. התבונן באטריום הימני על המשטח האנדוקרדיאלי למשולש של קוך. הוא יהיה גובל קדמית על ידי קו הציר של עלון המחיצה של שסתום tricuspid (טלוויזיה), ומאחור על ידי הגיד של Todaro. הפתח של הסינוס הכלילי נצפה בבסיס. (איור 1B, איור 2B).
   4. חותכים את המשולש של קוך, המכיל את AVN, ומכניסים אותו ישירות לצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מ"ל על קרח.

4. עיכול

1. יש להכין את מאגר העיכול (טבלה 1) זמן קצר לפני השימוש.
2. טחנו היטב את רקמת ה-SAN וה-AVN בעזרת אזמלים.
   הערה: טחינה טובה של הרקמה תגביר את יעילות העיכול ותעזור לקבל תרחיף תאים טוב למיון. מכיוון שדגימות SAN ו- AVN קטנות למדי, מומלץ לטחון את הרקמה ישירות בתוך צינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל כדי להפחית את אובדן הדגימה.
3. הוסף 500 μL של חיץ עיכול לכל דגימה ושטוף את כל הרקמות הטחונות מהקיר של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. צנרת עדינה מסייעת בעיכול הדגימה.
4. הומוגניזציה של הצינור במכונת מערבולת (הגדרות: 37 מעלות צלזיוס, 750 סל"ד למשך שעה).
5. לאחר העיכול, העבר את תרחיף הרקמה לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ"ל על ידי מעבר דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שטפו את מסננת התאים עם 5 מ"ל נוספים של חיץ מיון תאים כדי לעצור את העיכול.
6. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 350 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין באמצעות פיפטה. השהה את גלולת התא עם מאגר מיון תאים של 90 μL.
   הערה: לפני הפרדה מגנטית, פיפטה של מתלה התא בעדינות כמה פעמים או לעבור דרך מסננת תאים בגודל 30 מיקרומטר כדי להסיר גושים של תאים במידת הצורך, כדי לקבל תרחיף של תא בודד לביצועים אופטימליים של העשרה מגנטית של אוכלוסיות תאים מעניינות.

5. העשרה מגנטית של CD45 וכתמת דגימות

הערה: כדי לבודד את המקרופאגים הלבביים ביעילות מיון גבוהה, הרחקה של תאים לא רצויים כולל לימפוציטים בוצעה עם מיקרובי CD45 על פי פרוטוקול היצרן. בהתבסס על לוח המיון, מקרופאגים תושבי לב זוהו כ^-CD45 גבוה CD11b גבוה CD64^{גבוה Ly6C} נמוך / int F4^{/ 80 גבוה}.

1. הוסף 10 μL של מיקרובי CD45 לכל 10⁷ תאים סה"כ לתרחיף התא בצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל. מערבבים היטב את הדגימות ומדגרים אותן במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ספירת התאים באמצעות המוציטומטר צריכה להיעשות בקצרה כדי לוודא שכל צינור מכיל לא יותר מ 10⁷ תאים סה"כ. כאשר עובדים עם מספרי תאים גבוהים יותר, יש להגדיל את נפח החרוזים המגנטיים.
2. הכינו את תערובת הנוגדנים על ידי דילול הנוגדנים הבאים במאגר מיון התאים (דילול 1:100 לכל נוגדן): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI יתווסף מאוחר יותר לכתמים על אפליה של חיים/מתים.
3. לאחר 15 דקות של דגירה של חרוזים מגנטיים, הוסיפו 100 μL של תערובת נוגדנים ישירות לתוך תרחיף התאים בצינור 15 מ"ל (אז כל הריכוז הסופי של הנוגדנים הוא 1:200) ודגרה במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר 20 דקות של דגירה של נוגדנים, שטפו את מתלה התאים על ידי הוספת 1-2 מ"ל של מאגר מיון תאים לכל 10^{7 תאים} וצנטריפוגה בגודל 350 x g למשך 10 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט על ידי פיפטציה.
5. השהה עד 10⁸ תאים במאגר מיון תאים של 500 μL.
   הערה: מספר התא המרבי להפרדה מגנטית צריך להיקבע בהתאם לפרוטוקול היצרן.
6. הכינו את ערכת ההפרדה המגנטית.
   1. חברו את העמודה המגנטית למפריד מגנטי מתאים והניחו צינור איסוף מתחת לעמוד המגנטי.
   2. הכן את העמודות המגנטיות על ידי שטיפה עם מאגר מיון תאים: הוסף 500 μL של מאגר מיון תאים בראש העמודה ותן למאגר לעבור.
7. החל את השעיית התא באופן מיידי על העמודה בזמן שמאגר מיון התאים עובר דרכה.
   הערה: הימנע מהיווצרות בועות אוויר בעמודה. על פי פרוטוקול היצרן, למרות שזמן מילוי העמודות עשוי להשתנות מתנאי האחסון, אין לו השפעה על איכות ההפרדה.
8. שטפו את העמודה עם מאגר מיון תאים בגודל 3 x 500 μL. הזרימה בשלב 5.7 ובשלב 5.8 מכילה תאים ללא תווית, אותם ניתן להשליך אם אין צורך בניסוי נוסף.
   הערה: הוסף את מאגר מיון התאים מיד כאשר מאגר העמודות כמעט ריק.
9. הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והנח אותה על צינור איסוף חדש.
10. הוסף 1 מ"ל של מאגר מיון תאים לעמודה. יש לשטוף מיד את העמוד על ידי החלת הבוכנה המסופקת עם העמודה. הזרימה מכילה את התאים המסומנים מגנטית.
11. הוסף תמיסת DAPI לכל מתלי התאים המסומנים מגנטית שנאספו זמן קצר לפני הפעלתם על סדרן התאים. התאם את הריכוז הסופי של DAPI ל- 0.3-0.5 מיקרוגרם למ"ל.
12. בצע ניתוח FACS.

6. דוגמאות לפיצוי

1. הכן 6 צינורות מיקרוצנטריפוגה חומים בגודל 1.5 מ"ל המסומנים כ-"PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" ו-"DAPI" בהתאמה כדי להגן על נוגדנים מפני אור. הכן עוד שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת של 1.5 מ"ל המסומנת כ"לא מוכתמת ".
   הערה: זה יכול להיעשות באותו זמן כמו דגירה של תרחיף התא עם חיידקים ונוגדנים. הדגימה הלא מוכתמת יכולה להיות רקמת קרדיומיוציטים שנאספת באופן אקראי מרקמת הלב החסכה וגם מטופלת על פי שלב 4.
2. דלל כל נוגדן מצומד פלואורסצנטי יחיד עם חיץ מיון תאים ל-1:50 בצינורות מיקרוצנטריפוגה חומים בגודל 1.5 מ"ל המסומנים בהתאם.
3. מוסיפים טיפה אחת של תמיסת חרוזי פיצוי ומדגרים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. הוסף 2 מ"ל של מאגר מיון תאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה חום של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 450 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך לחלוטין את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את החרוז המכיל גלולה עם חיץ מיון תאים של 300 μL ולהעביר אותם לצינורות מיון תאים המסומנים גם הם בהתאם.

7. ריצה על סדרן התאים ואסטרטגיית גידור

1. החל תחילה את צינורות הדגימה והפיצוי הלא מוכתמים והתאם את המתחים של כל ערוץ כדי ליישר את השיא החיובי והשלילי למיקום הנכון של הציר. שמור את הגדרות הפיצוי והחל אותן על הדוגמאות הבאות.
2. החל את הדגימות על סדרן התאים. הגדר את אסטרטגיית הגידור כמתואר באיור 4. מקרופאגים תושבי לב מזוהים כ- CD45 גבוה CD11b^גבוהCD64^{גבוה Ly6Cנמוך / int} F4^{/ 80 גבוה}. DAPI משמש כסמן כדאיות תאים.
3. בדוק את תרשימי הציטומטריה של הזרימה כדי לוודא שאוכלוסיית התאים המעניינים מוצגת כראוי בתרשימים. אם לא, התאם את המתח של כל ערוץ לתצוגה המרכזית של כל תרשים.
4. אם הגדרות המתח משביעות רצון, התחל את הליך המיון. אסוף את אוכלוסיית התאים הממוינים לתרבית המורכבת מ-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי, בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-100 פניצילין U/mL.

8. תרבות מקרופאגים תושבים

1. לאחר איסוף המקרופאגים הממוינים, העבירו את התאים באופן מיידי לכלי תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ או ל-24 צלחות באר, או השתמשו בהם ישירות לניסויים הבאים.
2. כדי למיין מקרופאגים ממוינים בתרבית, לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס_{, 5%} CO 2 אינקובטור.
3. שנה את מדיום התרבות כל 48-72 שעות. תאים מתים צפים ניתנים להסרה בקלות על ידי שינוי בינוני. השתמש במקרופאגים חיים המחוברים לתחתית צלחת התרבית לצורך הניסוי הבא.

תוצאות

אנו מתארים הליך מעשי לבידוד של מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזור SAN ו- AVN. כדי לאשר דיסקציה נכונה, מבוצעים צביעת Trichrome של Masson וצביעת HCN4 אימונופלואורסצנטית (איור 3)¹². בעזרת פרוטוקול זה יכולנו לאסוף כ-60,000 מקרופאגים מלב שלם אחד. איור 4 מציג את אסטרטגיית ...

Discussion

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול להעשרת מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזורי SAN ו- AVN בטוהר גבוה.

מקרופאגים מחולקים לתת-אוכלוסיות על סמך מיקומם האנטומי והפנוטיפ התפקודי שלהם. הם יכולים גם לעבור מפנוטיפ פונקציונלי אחד למשנהו בתגובה לאותות מיקרו-סביבתיים משתנים¹³. בהשו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories