Выделение и культивирование резидентных сердечных макрофагов из мышиного синоатриального и атриовентрикулярного узла

Резюме

Протокол, представленный здесь, обеспечивает пошаговый подход к выделению сердечных резидентных макрофагов из области синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) мышечных сердец.

Аннотация

Было продемонстрировано, что резидентные сердечные макрофаги облегчают электрическую проводимость в сердце. Физиологический сердечный ритм инициируется электрическими импульсами, генерируемыми в синоатриальном узле (SAN), а затем проводится к желудочкам через атриовентрикулярный узел (AVN). Для дальнейшего изучения роли резидентных макрофагов в системе сердечной проводимости необходима правильная изоляция резидентных макрофагов от SAN и AVN, но это остается сложной задачей. Здесь мы предоставляем протокол для надежной микродиссекции SAN и AVN в сердцах мышей с последующей изоляцией и культивированием резидентных макрофагов.

Как SAN, который расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, так и AVN, который расположен на вершине треугольника Коха, идентифицируются и микрорассекаются. Правильное расположение подтверждается гистологическим анализом ткани, выполненным с помощью трихромного пятна Массона и анти-HCN4.

Затем микродиссеченные ткани ферментативно перевариваются с получением одноклеточных суспензий с последующей инкубацией со специфической панелью антител, направленных против специфических поверхностных маркеров клеточного типа. Это позволяет идентифицировать, подсчитывать или изолировать различные клеточные популяции с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток. Чтобы дифференцировать сердечные резидентные макрофаги от других иммунных клеток в миокарде, особенно от макрофагов, полученных из моноцитов, необходима деликатная разработанная стратегия гатирования. Во-первых, клетки лимфоидной линии обнаруживаются и исключаются из дальнейшего анализа. Затем миелоидные клетки идентифицируются с резидентными макрофагами, определяемыми высокой экспрессией как CD45, так и CD11b, и низкой экспрессией Ly6C. При сортировке клеток изолированные сердечные макрофаги затем могут культивироваться in vitro в течение нескольких дней для дальнейшего исследования. Поэтому мы описываем протокол выделения сердечных резидентных макрофагов, расположенных в системе сердечной проводимости. Мы обсуждаем подводные камни в микрорассекании и переваривании SAN и AVN, а также предоставляем стратегию захвата для надежной идентификации, подсчета и сортировки сердечных макрофагов с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток.

Введение

Синоатриальный узел (SAN) физиологически инициирует электрический импульс и, следовательно, является основным кардиостимулятором сердца. Атриовентрикулярный узел (AVN) проводит электрический импульс от предсердий к желудочкам, а также действует как вспомогательный кардиостимулятор¹. В целом, генерация и проведение электрических импульсов является сложным процессом, который может модулироваться различными факторами², включая резидентный макрофаг в областях SAN/AVN. Недавнее исследование Hulsmans et al. демонстрирует специфическую популяцию сердечных резидентных макрофагов, которые обогащены AVN и функционируют как ключевые игроки в поддержании устойчивого сердцебиения³. Они обнаружили, что макрофаги электрически связаны с кардиомиоцитами и могут изменять электрические свойства связанных кардиомиоцитов. Авторы также отмечают, что такие проводящие клетки, чередующиеся с макрофагами, присутствуют и в других компонентах системы сердечной проводимости, таких как SAN.

В настоящее время до конца не известно, отличается ли фенотип резидентных сердечных макрофагов между сердечными областями. Однако было показано, что микроокружение тканей может влиять на транскрипцию и пролиферативное обновление тканевых макрофагов⁴. Кроме того, поскольку было продемонстрировано, что фенотип кардиомиоцитов различается между областями, функциональное воздействие макрофагов на кардиомиоциты также может быть специфичным для региона, даже если сам фенотип макрофага может быть одинаковым. Поэтому необходимы дальнейшие исследования конкретных сердечных областей.

Недавние исследования показали, что в устойчивом состоянии тканевые резидентные макрофаги устанавливаются пренатально, возникая независимо от окончательного кроветворения, и сохраняются во взрослом возрасте⁵. Однако после истощения макрофагов или во время воспаления сердца моноциты Ly6c^hi способствуют пополнению популяции макрофагов сердца⁶. Исследования, включающие отслеживание генетической линии, парабиоз, картирование судьбы и отслеживание клеток, показали сосуществование различных популяций макрофагов-резидентов тканей в органах и тканях, а также различное клеточное поведение подмножеств макрофагов, которые потенциально связаны с их онтогенезом ^7,8,9.

Характеристика резидентных сердечных макрофагов выиграла от использования магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) и флуоресцентной активированной сортировки клеток. Эти методы особенно полезны для выделения специфических клеточных популяций из нескольких тканевых фракций путем маркировки их маркерами клеточной поверхности. Это не только приводит к более высокой чистоте изолированного типа иммунных клеток, но и позволяет проводить фенотипический анализ. Здесь мы представляем протокол, включающий магнитные клетки, покрытые шариками, с последующей флуоресцентной активированной сортировкой клеток для обогащения сердечных резидентных макрофагов, специально выделенных из области SAN и AVN.

Для изучения характеристик сердечных резидентных макрофагов в проводящей системе и их функции для сердечной проводимости и аритмогенеза решающее значение имеют точная локализация и рассечение SAN и AVN. Для микродиссекции SAN и AVN для идентификации региона¹⁰ используются анатомические ориентиры. Короче говоря, SAN расположен на стыке верхней полой вены и правого предсердия. AVN расположен в треугольнике Коха, который спереди граничит с перегородочным листком трикуспидального клапана, а сзади сухожилием Тодаро¹¹. Мы также предоставляем точную процедуру микродиссекции SAN и AVN у мышей, что подтверждается гистологическим и иммунофлуоресцентным окрашиванием.

Изолированные резидентные макрофаги могут быть использованы для дальнейших экспериментов, таких как секвенирование РНК, или могут быть восстановлены и культивированы в течение более двух недель, что позволяет проводить различные эксперименты in vitro. Поэтому наш протокол описывает очень ценную процедуру для иммуноритмолога. В таблице 1 показан состав всех необходимых решений, на рисунке 1 показаны ориентиры микродиссекции для SAN и AVN. На рисунке 2 приведена схематическая иллюстрация локализации SAN и AVN. На рисунке 3 показано гистологическое окрашивание SAN и AVN (трихромное и иммунофлуоресцентное окрашивание Массона). На рисунке 4 показана пошаговая стратегия гатинга для изоляции сердечных резидентных макрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток.

протокол

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, и все процедуры, предпринятые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия. Мыши C57BL6/J были коммерчески получены.

1. Препараты

1. Подготовьте буфер сортировки ячеек (таблица 1) и храните при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всей экспериментальной процедуры буфер сортировки клеток всегда должен находиться на льду.
2. Подготовьте буфер пищеварения (таблица 1) незадолго до переваривания, так как активность коллагеназы могла быть обнаружена только в течение нескольких часов при комнатной температуре.
3. Обратитесь к ранее опубликованному протоколу приготовления блюда¹⁰ для вскрытия. Вкратце, добавьте 30 мл агарозного геля (3%-4%) в чашку Петри диаметром 100 мм и охладите при комнатной температуре.

2. Жертвоприношение животных и иссечение сердца

1. Обезболивают мышь изофлураном, помещая его в инкубационную камеру, связанную с испарителем изофлурана и промывая 5% изофлураном/95% кислорода.
2. После инъекции фентанила для обезболивания откройте грудную клетку и перфузируйте сердце, введя 5-10 мл ледяного 1x PBS непосредственно в левый желудочек (LV). Извлеките сердце мышей и положите его на тарелку для рассечения. Экспериментальные детали были подробно описаны ранее¹⁰.

3. Микродиссекция SAN и AVN

1. После изоляции сердца выполните следующие процедуры микродиссекции в тарелке для рассечения с ледяным холодом 1x PBS под рассекающим микроскопом.
2. Используйте анатомические ориентиры сердца, т.е. аорту, легочную артерию, коронарный синус, левый/правый желудочек и т.д. для определения левого/правого (слева: ЛЖ; правого: RV) и переднего/заднего (переднего: аорты; заднего: коронарного синуса) сердца. После того, как ориентация определена, оборачивайте сердце передней его частью на дне тарелки (чтобы обнажить крупные вены, которые расположены сзади).
3. Микродиссекция SAN
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микродиссекция SAN была ранее описана¹⁰. Процесс кратко описан ниже.
   1. Обнажите межкаваловую область, защемляя правые предсердные придатки (RAA) и ткань, прилегающую к верхней полой вене (SVC) и нижней полой вене (IVC) на микродиссекционной тарелке с помощью штифтов насекомых.
   2. Разрезаем сердце вдоль межпредсердной перегородки параллельно crista terminalis (CT), чтобы отделить межкаваловую область и получить образец SAN (рисунок 1A, рисунок 2A). Поместите образец в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.
4. Микродиссекция AVN
   1. После сбора образца SAN убедитесь, что РАА и части правого предсердия (РА) уже были отрезаны, оставив только межпредсердную перегородку (IAS) и межжелудочковую перегородку (IVS).
   2. Проведите оставшиеся части сердца через ткань, прилегающую к IAS и IVS, используя штифты насекомых, чтобы сделать правую предсердную сторону IAS обращенной вверх.
   3. Посмотрите на правое предсердие на поверхности эндокарда для треугольника Коха. Он будет окаймлен спереди шарнирной линией перегородчатого листа трикуспидального клапана (TV) и сзади сухожилием Тодаро. Отверстие коронарного синуса наблюдается у основания. (Рисунок 1B, Рисунок 2B).
   4. Вырежьте треугольник Коха, который содержит AVN, и непосредственно поместите его в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.

4. Пищеварение

1. Подготовьте буфер пищеварения (таблица 1) незадолго до использования.
2. Измельчите ткань SAN и AVN скальпелями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение ткани хорошо повысит эффективность пищеварения и поможет получить хорошую клеточную суспензию для сортировки. Поскольку образцы SAN и AVN довольно малы, рекомендуется измельчение ткани непосредственно внутри микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл для уменьшения потерь образца.
3. Добавьте 500 мкл буфера пищеварения на образец и смойте всю измельченную ткань со стенки пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Мягкое пипетирование помогает переварить образец.
4. Гомогенизируйте трубку на вихревой машине (настройки: 37 °C, 750 об/мин в течение 1 ч).
5. После переваривания перенесите суспензию ткани в свежую центрифужную трубку объемом 15 мл, пройдя через клеточное ситечко 40 мкм. Промыть клеточный ситечко дополнительными 5 мл буфера сортировки клеток, чтобы остановить пищеварение.
6. Центрифугировать трубку 15 мл при 350 х г в течение 7 мин при 4 °C. Затем удалите супернатант полностью с помощью пипетки. Повторное суспендирование гранулы ячейки с буфером сортировки клеток 90 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед магнитным разделением пипетку клеточной суспензии осторожно несколько раз или пройдите через 30-мкм клеточный сетчатый фильтр для удаления сгустков клеток, если это необходимо, для получения одноклеточной суспензии для оптимального выполнения магнитного обогащения интересных клеточных популяций.

5. Магнитное обогащение CD45 и окрашивание образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения сердечных макрофагов с высокой эффективностью сортировки исключение нежелательных клеток, включая лимфоциты, проводили с помощью микрошариков CD45 в соответствии с протоколом производителя. Основываясь на сортировочной панели, сердечные резидентные макрофаги были идентифицированы как CD45^{с высоким}CD11b^{с высоким cd64высоким} Ly6C^{низким / int} F4 / 80^{высоким}.

1. Добавьте 10 мкл микрогранул CD45 на 10⁷ общих клеток к клеточной суспензии в 15 мл центрифужной трубки. Хорошо перемешайте образцы и инкубируйте их в течение 15 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток с помощью гемоцитометра должен быть кратковременным, чтобы убедиться, что каждая трубка содержит не более 10⁷ общих клеток. При работе с более высокими числами ячеек объем магнитных шариков необходимо увеличить.
2. Приготовьте смесь антител путем разбавления следующих антител в буфере сортировки клеток (разведение 1:100 для каждого антитела): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI будет добавлен позже к окрашиванию для живой/мертвой дискриминации.
3. После 15 мин инкубации магнитного шарика добавляют 100 мкл смеси антител непосредственно в клеточную суспензию в пробирке объемом 15 мл (тогда конечная концентрация всех антител составляет 1:200) и инкубируют в течение 20 мин при 4 °C.
4. После 20 мин инкубации антител промыть клеточную суспензию, добавив 1-2 мл клеточного сортировочного буфера на 10⁷ клеток и центрифугу при 350 х г в течение 10 мин. Полностью удалить супернатант путем пипетки.
5. Повторное суспендирование до 10⁸ ячеек в 500 мкл клеточного сортировочного буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное число ячеек для магнитной сепарации должно определяться в соответствии с протоколом завода-изготовителя.
6. Подготовьте комплект магнитной сепарации.
   1. Прикрепите магнитную колонну к подходящему магнитному сепаратору и поместите коллекторную трубку под магнитную колонну.
   2. Подготовьте магнитные колонны, промыв с помощью буфера сортировки ячеек: добавьте 500 мкл буфера сортировки ячеек в верхней части столбца и дайте буферу пройти.
7. Немедленно примените приостановку ячейки к столбцу во время прохождения буфера сортировки ячеек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха в колонне. В соответствии с протоколом производителя, хотя время заполнения колонны может изменяться в зависимости от условий хранения, оно не влияет на качество разделения.
8. Промывайте колонну буфером сортировки ячеек размером 3 x 500 мкл. Проточные на стадии 5.7 и стадии 5.8 содержат немаркированные ячейки, которые могут быть отброшены, если не требуется дальнейший эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер сортировки ячеек сразу же, когда резервуар столбца почти пуст.
9. Извлеките колонну из магнитного сепаратора и поместите ее на новую коллекторную трубку.
10. Добавьте в столбец 1 мл буфера сортировки ячеек. Немедленно промыть колонну, плотно применив плунжер, поставляемый вместе с колонной. Проточный содержит магнитно меченые ячейки.
11. Добавьте раствор DAPI во все собранные суспензии клеток с магнитной маркировкой незадолго до запуска их на сортировщике ячеек. Отрегулируйте конечную концентрацию DAPI до 0,3-0,5 мкг/мл.
12. Выполните анализ FACS.

6. Образцы для компенсации

1. Подготовьте 6 коричневых микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл с маркировкой «PE», «APC-Cy7», «APC», «PE-Cy7», «FITC» и «DAPI» соответственно для защиты антител от света. Подготовьте еще одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с маркировкой «неокрашенная».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано одновременно с инкубацией клеточной суспензии с микрошариками и антителами. Незапятнанный образец может представлять собой ткань кардиомиоцитов, собранную случайным образом из сохраненной ткани сердца, а также обработанную в соответствии с этапом 4.
2. Разбавьте каждое отдельное флуоресцентно-конъюгированное антитело с буфером сортировки клеток в 1:50 в 1,5 мл коричневых микроцентрифужных трубках, которые помечены соответствующим образом.
3. Добавить одну каплю раствора компенсационных шариков и инкубировать в течение 20 мин при 4 °C.
4. Добавьте 2 мл клеточного сортировочного буфера в каждую 1,5 мл коричневой микроцентрифужной трубки и центрифугу при 450 х г в течение 5 мин. Полностью отбросьте супернатант и повторно суспендируйте шарик, содержащий гранулы, с буфером сортировки клеток 300 мкл и переложите их в трубки сортировщика ячеек, которые также помечены соответствующим образом.

7. Запуск на сортировщике ячеек и стратегия гатинга

1. Сначала нанесите неокрашенные пробоотборники и компенсационные трубки и отрегулируйте напряжение каждого канала, чтобы выровнять как положительный, так и отрицательный пик в правильном положении оси. Сохраните параметры компенсации и примените их к следующим примерам.
2. Примените образцы на сортировщике ячеек. Установите стратегию затвора, как показано на рисунке 4. Сердечные резидентные макрофаги идентифицируются как CD45^{с высоким}CD11b^{с высоким cd64высоким}Ly6C^{низким / int} F4 / 80^{высоким}. DAPI используется в качестве маркера жизнеспособности клеток.
3. Проверьте диаграммы проточной цитометрии, чтобы убедиться, что интересующая популяция клеток правильно показана на диаграммах. Если нет, отрегулируйте напряжение каждого канала в центральном представлении каждого графика.
4. Если настройки напряжения удовлетворительны, запустите процедуру сортировки. Соберите отсортированную клеточную популяцию в культуральную среду, состоящую из ДМЭМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, дополненной 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл пенициллина.

8. Культура резидентных макрофагов

1. После сбора отсортированных макрофагов перенесите клетки сразу либо на 35 мм тканей культуры посуды, либо на 24-луночную пластину, либо непосредственно используйте их для последующих экспериментов.
2. Для культивирования отсортированных макрофагов инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO₂ инкубатора.
3. Менять питательную среду каждые 48-72 ч. Плавающие мертвые клетки могут быть легко удалены путем изменения среды. Используйте живые макрофаги, прикрепленные к дну культуральной посуды для последующего эксперимента.

Результаты

Описана практическая процедура выделения сердечных резидентных макрофагов конкретно из области SAN и AVN. Для подтверждения правильного рассечения проводится трихромное окрашивание Массона и иммунофлуоресцентное окрашивание HCN4 (рисунок 3)¹². С помощью этого...

Обсуждение

В этой рукописи мы описываем протокол обогащения сердечных резидентных макрофагов конкретно из областей SAN и AVN с высокой чистотой.

Макрофаги делятся на субпопуляции в зависимости от их анатомического расположения и функционального фенотипа. Они также могут переключат?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories