Isolement et culture de macrophages cardiaques résidents du nœud sino-auriculaire murin et auriculo-ventriculaire

Résumé

Le protocole présenté ici fournit une approche étape par étape pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents de la région du ganglion sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) du cœur de souris.

Résumé

Il a été démontré que les macrophages cardiaques résidents facilitent la conduction électrique dans le cœur. Le rythme cardiaque physiologique est initié par des impulsions électriques générées dans le nœud sino-auriculaire (SAN), puis conduites vers les ventricules via le nœud auriculo-ventriculaire (AVN). Pour étudier plus avant le rôle des macrophages résidents dans le système de conduction cardiaque, une isolation appropriée des macrophages résidents du SAN et de l’AVN est nécessaire, mais cela reste difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour la microdissection fiable du SAN et de l’AVN dans les cœurs murins, suivie de l’isolement et de la culture des macrophages résidents.

Le SAN, situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure, et l’AVN, situé au sommet du triangle de Koch, sont identifiés et microdisséqués. L’emplacement correct est confirmé par l’analyse histologique du tissu réalisée avec la coloration trichrome de Masson et par l’anti-HCN4.

Les tissus microdisséqués sont ensuite digérés par voie enzymatique pour obtenir des suspensions unicellulaires suivies de l’incubation avec un panel spécifique d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire. Cela permet d’identifier, de compter ou d’isoler différentes populations cellulaires par tri cellulaire activé par fluorescence. Pour différencier les macrophages cardiaques résidents des autres cellules immunitaires du myocarde, en particulier des macrophages dérivés de monocytes recrutés, une stratégie de déclenchement délicate est nécessaire. Tout d’abord, les cellules de la lignée lymphoïde sont détectées et exclues d’une analyse plus approfondie. Ensuite, les cellules myéloïdes sont identifiées avec des macrophages résidents déterminés par une expression élevée de CD45 et CD11b, et une faible expression de Ly6C. Avec le tri cellulaire, des macrophages cardiaques isolés peuvent ensuite être cultivés in vitro pendant plusieurs jours pour une étude plus approfondie. Nous décrivons donc un protocole pour isoler les macrophages résidents cardiaques situés dans le système de conduction cardiaque. Nous discutons des pièges de la microdissection et de la digestion du SAN et de l’AVN, et fournissons une stratégie de contrôle pour identifier, compter et trier de manière fiable les macrophages cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.

Introduction

Le nœud sino-auriculaire (SAN) initie physiologiquement l’impulsion électrique et est donc le principal stimulateur cardiaque du cœur. Le nœud auriculo-ventriculaire (AVN) conduit l’impulsion électrique des oreillettes aux ventricules et agit également comme un stimulateur cardiaque auxiliaire¹. En général, la génération et la conduction d’impulsions électriques est un processus complexe qui peut être modulé par divers facteurs², y compris les macrophages résidents dans les régions SAN / AVN. Une étude récente de Hulsmans et al. démontre une population spécifique de macrophages cardiaques résidents qui sont enrichis en AVN et fonctionnent comme des acteurs clés dans le maintien d’un rythme cardiaque régulier³. Ils ont constaté que les macrophages sont couplés électriquement aux cardiomyocytes et pourraient modifier les propriétés électriques des cardiomyocytes couplés. Les auteurs notent également que de telles cellules conductrices s’entrelacent avec les macrophages sont également présentes dans d’autres composants du système de conduction cardiaque, tels que le SAN.

Actuellement, on ne sait pas exactement si le phénotype des macrophages cardiaques résidents diffère entre les régions cardiaques. Cependant, il a été démontré que le microenvironnement tissulaire peut affecter la transcription et le renouvellement prolifératif des macrophages tissulaires⁴. De plus, puisqu’il a été démontré que le phénotype des cardiomyocytes est différent d’une région à l’autre, les effets fonctionnels des macrophages sur les cardiomyocytes peuvent également être spécifiques à une région, même si le phénotype du macrophage lui-même peut être le même. Par conséquent, d’autres études sur des régions cardiaques spécifiques sont nécessaires.

Des études récentes ont démontré qu’à l’état d’équilibre, les macrophages résidents tissulaires sont établis avant la naissance, apparaissant indépendamment de l’hématopoïèse définitive, et persistent jusqu’à l’âge adulte⁵. Cependant, après l’épuisement des macrophages ou lors d’une inflammation cardiaque, les monocytes Ly6c^hi contribuent à reconstituer la population de macrophages cardiaques⁶. Des études impliquant le traçage génétique de la lignée, la parabiose, la cartographie du destin et le suivi cellulaire ont montré la coexistence d’une variété de populations de macrophages résidents dans les organes et les tissus, ainsi que le comportement cellulaire différent des sous-ensembles de macrophages potentiellement associés à leur ontogenèse ^7,8,9.

La caractérisation des macrophages cardiaques résidents a bénéficié de l’utilisation du tri des cellules activées magnétiques (MACS) et du tri des cellules activées par fluorescence. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour isoler des populations cellulaires spécifiques de plusieurs fractions tissulaires en les marquant avec leurs marqueurs de surface cellulaire. Cela conduit non seulement à une plus grande pureté du type de cellule immunitaire isolée, mais permet également une analyse phénotypique. Ici, nous présentons un protocole comprenant des cellules recouvertes de billes magnétiques suivies d’un tri cellulaire activé par fluorescence pour l’enrichissement des macrophages résidents cardiaques spécifiquement isolés de la région SAN et AVN.

Pour explorer les caractéristiques des macrophages cardiaques résidents dans le système de conduction et leur fonction pour la conduction cardiaque et l’arythmogenèse, une localisation et une dissection précises du SAN et de l’AVN sont essentielles. Pour la microdissection du SAN et de l’AVN, des repères anatomiques sont utilisés pour l’identification de la région¹⁰. En bref, le SAN est situé à la jonction de la veine cave supérieure et de l’oreillette droite. AVN est situé dans le triangle de Koch, qui est bordé antérieurement par le feuillet septal de la valve tricuspide, et postérieurement par le tendon de Todaro¹¹. Nous fournissons également une procédure de microdissection précise du SAN et de l’AVN chez la souris, confirmée par histologie et coloration par immunofluorescence.

Des macrophages résidents isolés pourraient être utilisés pour d’autres expériences telles que le séquençage de l’ARN ou pourraient être récupérés et cultivés pendant plus de deux semaines, ce qui permettrait diverses expériences in vitro. Par conséquent, notre protocole décrit une procédure très précieuse pour l’immuno-rythmologiste. Le tableau 1 montre la composition de toutes les solutions nécessaires, la figure 1 montre les repères de microdissection pour SAN et AVN. La figure 2 illustre schématiquement la localisation SAN et AVN. La figure 3 montre la coloration histologique du SAN et de l’AVN (coloration trichrome et immunofluorescence de Masson). La figure 4 montre une stratégie de contrôle étape par étape pour isoler les macrophages résidents cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.

Protocole

Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne. Les souris C57BL6/J ont été obtenues commercialement.

1. Préparatifs

1. Préparer le tampon de tri des cellules (tableau 1) et conserver à 4 °C.
   REMARQUE: Pendant toute la procédure expérimentale, le tampon de tri cellulaire doit toujours être sur la glace.
2. Préparer le tampon de digestion (tableau 1) peu de temps avant la digestion, car l’activité de la collagénase n’a pu être détectée que pendant quelques heures à température ambiante.
3. Se référer au protocole précédemment publié pour la préparation de la boîte de dissection¹⁰. En bref, ajouter 30 mL de gel d’agarose (3 % à 4 %) dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre et laisser refroidir à température ambiante.

2. Sacrifice d’animaux et excision cardiaque

1. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane en la plaçant dans une chambre d’incubation reliée à un vaporisateur d’isoflurane et rincée avec 5% d’isoflurane / 95% d’oxygène.
2. Après l’injection de fentanyl pour l’analgésie, ouvrez la cage thoracique et perfuser le cœur en injectant 5 à 10 mL de 1x PBS glacé directement dans le ventricule gauche (LV). Extrayez le cœur de souris et mettez-le sur le plat de dissection. Les détails expérimentaux ont été décrits en détail précédemment¹⁰.

3. Microdissection du SAN et de l’AVN

1. Après avoir isolé le cœur, effectuez les procédures de microdissection suivantes dans la boîte de dissection avec 1x PBS glacé au microscope à dissection.
2. Utilisez les repères anatomiques cardiaques, c’est-à-dire l’aorte, l’artère pulmonaire, les sinus coronaires, le ventricule gauche / droit, etc. pour déterminer la gauche/droite (gauche : LV; droite : RV) et antérieure/postérieure (antérieure : aorte; postérieure : sinus coronaire) du cœur. Une fois l’orientation déterminée, tournez autour du cœur avec le devant de celui-ci au bas du plat (pour exposer les grosses veines situées à l’arrière).
3. Microdissection du SAN
   REMARQUE : La microdissection du SAN a déjà été décrite¹⁰. Le processus est décrit brièvement ci-dessous.
   1. Exposer la région inter-cavale en épinglant les appendices auriculaires droits (RAA) et le tissu adjacent à la veine cave supérieure (SVC) et à la veine cave inférieure (IVC) sur la boîte de microdissection à l’aide d’épingles à insectes.
   2. Couper le cœur le long du septum interauriculaire parallèle à la crista terminalis (CT) pour séparer la région inter-cavale et obtenir l’échantillon SAN (Figure 1A, Figure 2A). Placez l’échantillon dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 mL sur de la glace.
4. Microdissection de l’AVN
   1. Après le prélèvement de l’échantillon SAN, assurez-vous que le RAA et certaines parties de l’oreillette droite (PR) ont déjà été coupés, ne laissant que le septum interauriculaire (IAS) et le septum interventriculaire (IVS).
   2. Épinglez les parties restantes du cœur à travers le tissu adjacent à l’IAS et à l’IVS à l’aide d’épingles à insectes pour rendre le côté auriculaire droit de l’IAS orienté vers le haut.
   3. Regardez l’oreillette droite sur la surface endocardique pour le triangle de Koch. Il sera bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide (TV), et postérieurement par le tendon de Todaro. L’orifice du sinus coronaire est observé à la base. (Figure 1B, Figure 2B).
   4. Coupez le triangle de Koch, qui contient l’AVN, et placez-le directement dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 ml sur de la glace.

4. Digestion

1. Préparer le tampon de digestion (tableau 1) peu de temps avant utilisation.
2. Hachez bien les tissus SAN et AVN avec des scalpels.
   REMARQUE: Bien hacher le tissu augmentera l’efficacité de la digestion et aidera à obtenir une bonne suspension cellulaire pour le tri. Comme les échantillons SAN et AVN sont assez petits, il est recommandé de hacher le tissu directement à l’intérieur du tube microcentrifuge de 1,5 ml pour réduire la perte d’échantillon.
3. Ajouter 500 μL de tampon de digestion par échantillon et laver tous les tissus hachés de la paroi du tube microcentrifuge de 1,5 mL. Un pipetage doux aide à digérer l’échantillon.
4. Homogénéiser le tube sur une machine vortex (réglages : 37 °C, 750 tr/min pendant 1 h).
5. Après digestion, transférer la suspension tissulaire dans un tube centrifugeux frais de 15 ml en passant à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Rincer la passoire cellulaire avec 5 mL supplémentaires de tampon de tri cellulaire pour arrêter la digestion.
6. Centrifuger le tube de 15 mL à 350 x g pendant 7 min à 4 °C. Retirez ensuite complètement le surnageant à l’aide de la pipette. Remettez en suspension la pastille de cellule avec un tampon de tri de cellule de 90 μL.
   REMARQUE: Avant la séparation magnétique, pipeter doucement la suspension cellulaire plusieurs fois ou passer à travers une crépine cellulaire de 30 μm pour éliminer les amas cellulaires si nécessaire, afin d’obtenir une suspension unicellulaire pour une performance optimale d’enrichissement magnétique des populations cellulaires intéressantes.

5. Enrichissement magnétique du CD45 et coloration des échantillons

REMARQUE: Pour isoler les macrophages cardiaques avec une efficacité de tri élevée, l’exclusion des cellules indésirables, y compris les lymphocytes, a été réalisée avec des microbilles CD45 conformément au protocole du fabricant. Sur la base du panel de tri, les macrophages résidents cardiaques ont été identifiés comme CD45 élevé CD11b élevé CD64 élevé Ly6C faible / int F4^{/ 80 élevé}.

1. Ajouter 10 μL de microbilles CD45 par 10⁷ cellules totales à la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger de 15 mL. Bien mélanger les échantillons et les incuber pendant 15 min à 4 °C.
   REMARQUE: Le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre doit être brièvement effectué pour s’assurer que chaque tube ne contient pas plus de 10⁷ cellules au total. Lorsque vous travaillez avec un nombre de cellules plus élevé, le volume de billes magnétiques doit être augmenté.
2. Préparer le mélange d’anticorps en diluant les anticorps suivants dans un tampon de tri cellulaire (dilution 1:100 pour chaque anticorps) : CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI sera ajouté plus tard à la coloration pour discrimination vivante / morte.
3. Après 15 min d’incubation du bille magnétique, ajouter 100 μL de mélange d’anticorps directement dans la suspension cellulaire dans le tube de 15 ml (alors la concentration finale de tous les anticorps est de 1:200) et incuber pendant 20 min à 4 °C.
4. Après 20 min d’incubation d’anticorps, laver la suspension cellulaire en ajoutant 1-2 mL de tampon de tri cellulaire pour 10 à 7 cellules et centrifuger^à 350 x g pendant 10 min. Retirer complètement le surnageant par pipetage.
5. Remettez en suspension jusqu’à 10⁸ cellules dans 500 μL de tampon de tri cellulaire.
   REMARQUE: Le nombre maximal de cellules pour la séparation magnétique doit être déterminé conformément au protocole du fabricant.
6. Préparez le jeu de séparation magnétique.
   1. Fixez la colonne magnétique à un séparateur magnétique approprié et placez un tube de collecte sous la colonne magnétique.
   2. Préparer les colonnes magnétiques en les rinçant avec un tampon de tri cellulaire : ajouter 500 μL de tampon de tri cellulaire en haut de la colonne et laisser passer le tampon.
7. Appliquez immédiatement la suspension de cellules sur la colonne pendant le passage du tampon de tri des cellules.
   REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air dans la colonne. Selon le protocole du fabricant, bien que le temps de remplissage de la colonne puisse changer par rapport aux conditions de stockage, il n’a aucune influence sur la qualité de la séparation.
8. Lavez la colonne avec un tampon de tri cellulaire de 3 x 500 μL. Le flux continu des étapes 5.7 et 5.8 contient des cellules non étiquetées, qui peuvent être éliminées si aucune expérience supplémentaire n’est nécessaire.
   Remarque : Ajoutez le tampon de tri de cellule immédiatement lorsque le réservoir de colonne est presque vide.
9. Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube de collecte.
10. Ajouter 1 mL de tampon de tri cellulaire sur la colonne. Rincez immédiatement la colonne en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne. Le flux continu contient les cellules marquées magnétiquement.
11. Ajoutez une solution DAPI dans toutes les suspensions de cellules marquées magnétiquement collectées peu de temps avant de les exécuter sur le trieur de cellules. Ajuster la concentration finale de DAPI à 0,3-0,5 μg/mL.
12. Effectuer l’analyse FACS.

6. Échantillons pour compensation

1. Préparez 6 tubes microcentrifugés bruns de 1,5 ml étiquetés respectivement « PE », « APC-Cy7 », « APC », « PE-Cy7 », « FITC » et « DAPI » pour protéger les anticorps de la lumière. Préparez un autre tube microcentrifuge de 1,5 mL étiqueté « non coloré ».
   REMARQUE: Cela pourrait être fait en même temps que l’incubation de la suspension cellulaire avec les microbilles et les anticorps. L’échantillon non coloré pourrait être le tissu cardiomyocytaire prélevé au hasard dans le tissu cardiaque épargné et également traité conformément à l’étape 4.
2. Diluer chaque anticorps conjugué à la fluorescence avec tampon de tri cellulaire en 1:50 dans les tubes de microcentrifugation bruns de 1,5 mL marqués en conséquence.
3. Ajouter une goutte de solution de billes de compensation et incuber pendant 20 min à 4 °C.
4. Ajouter 2 mL de tampon de tri cellulaire dans chaque tube de microcentrifugation brun de 1,5 mL et centrifuger à 450 x g pendant 5 min. Jetez complètement le surnageant et remettez en suspension le billon contenant la pastille avec un tampon de tri cellulaire de 300 μL et transférez-les dans des tubes de tri de cellules qui sont également marqués en conséquence.

7. Exécution sur le trieur de cellules et stratégie de contrôle

1. Appliquez d’abord les tubes d’échantillon et de compensation non colorés et ajustez les tensions de chaque canal pour aligner le pic positif et négatif sur la position appropriée de l’axe. Enregistrez les paramètres de compensation et appliquez-les aux exemples suivants.
2. Appliquez les échantillons sur le trieur de cellules. Définissez la stratégie de contrôle comme décrit à la figure 4. Les macrophages résidents cardiaques sont identifiés comme CD45CD11b élevé^CD64élevé Ly6C faible/int F4^{/80 élevé}. DAPI est utilisé comme marqueur de viabilité cellulaire.
3. Vérifiez les diagrammes de cytométrie de flux pour confirmer que la population cellulaire d’intérêt est correctement indiquée sur les graphiques. Sinon, réglez la tension de chaque canal à la vue centrale de chaque graphique.
4. Si les réglages de tension sont satisfaisants, lancez la procédure de tri. Recueillir la population cellulaire triée dans un milieu de culture composé de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal, complété par 100 μg/mL de streptomycine et 100 U/mL de pénicilline.

8. Culture de macrophages résidents

1. Après avoir recueilli les macrophages triés, transférer immédiatement les cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 35 mm ou dans une plaque de 24 puits, ou les utiliser directement pour des expériences ultérieures.
2. Pour mettre en culture des macrophages triés, incuber les cellules à 37 °C, incubateur à 5% de CO₂ .
3. Changez le milieu de culture toutes les 48-72 h. Les cellules mortes flottantes peuvent être facilement éliminées par changement de milieu. Utilisez des macrophages vivants qui se fixent au fond de la boîte de culture pour une expérience ultérieure.

Résultats

Nous décrivons une procédure pratique pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement de la région SAN et AVN. Pour confirmer une dissection correcte, la coloration trichrome de Masson et la coloration HCN4 immunofluorescente sont effectuées (Figure 3)¹². Avec ce protocole, nous pourrions collecter environ 60 000 macrophages d’un cœur entier. La figure 4 montre la stratégie de contrôle pour le tri des mac...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’enrichissement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement des régions SAN et AVN à haute pureté.

Les macrophages sont divisés en sous-populations en fonction de leur emplacement anatomique et de leur phénotype fonctionnel. Ils peuvent également passer d’un phénotype fonctionnel à un autre en réponse à des signaux microenvironnementaux variables¹³. Comparativement à d’autres organes comme ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories