マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

要約

ここで紹介するプロトコルは、マウス心臓の洞房結節(SAN)および房室結節(AVN)領域から心臓常在マクロファージを単離するための段階的なアプローチを提供します。

要約

常在する心臓マクロファージは、心臓における電気伝導を促進することが実証されている。生理学的な心調律は、洞房結節(SAN)で生成された電気インパルスによって開始され、房室結節(AVN)を介して心室に伝導されます。心臓伝導系における常在マクロファージの役割をさらに研究するには、常在マクロファージをSANおよびAVNから適切に分離する必要がありますが、依然として困難です。ここでは、マウス心臓におけるSANとAVNの信頼性の高いマイクロダイセクションとそれに続く常在マクロファージの単離と培養のためのプロトコルを提供します。

クリスタターミナルと上大静脈の接合部に位置するSANと、コッホの三角形の頂点に位置するAVNの両方が同定され、マイクロディスセクションされます。正しい位置は、マッソンのトリクローム染色および抗HCN4で行われた組織の組織学的分析によって確認されます。

次に、マイクロ解剖組織を酵素的に消化して単一細胞懸濁液を取得し、続いて細胞型特異的表面マーカーに対する抗体の特異的パネルとインキュベートします。これにより、蛍光活性化細胞ソーティングによって異なる細胞集団を同定、カウント、または単離することができる。心臓に常在するマクロファージを心筋内の他の免疫細胞、特に動員された単球由来のマクロファージと区別するには、繊細なゲーティング戦略が必要です。まず、リンパ系譜細胞を検出し、さらなる分析から除外します。次に、骨髄系細胞は、CD45およびCD11bの両方の高発現、およびLy6Cの低発現によって決定される常在マクロファージと同定される。細胞選別により、単離された心臓マクロファージをin vitroで数日間培養し、さらなる調査を行うことができます。したがって、心臓伝導系内にある心臓常在マクロファージを単離するためのプロトコルについて説明します。SANとAVNのマイクロ解剖と消化の落とし穴について説明し、蛍光活性化細胞ソーティングによって心臓マクロファージを確実に識別、カウント、およびソートするためのゲーティング戦略を提供します。

概要

洞房結節(SAN)は生理学的に電気インパルスを開始するため、心臓の主要なペースメーカーです。房室結節(AVN)は、心房から心室に電気インパルスを伝導し、補助ペースメーカー^{としても機能します1}。一般に、電気インパルスの生成と伝導は、SAN/AVN領域に常在するマクロファージを含むさまざまな要因²によって調節できる複雑なプロセスです。Hulsmansらによる最近の研究は、AVNに富み、安定した心拍を維持するための主要なプレーヤーとして機能する心臓常在マクロファージの特定の集団を示しています³。彼らは、マクロファージが心筋細胞と電気的に結合しており、結合した心筋細胞の電気的特性を変化させる可能性があることを発見しました。著者たちはまた、マクロファージとインターリーブするこのような伝導細胞が、SANなどの心臓伝導系の他の構成要素にも存在することも指摘している。

現在、常在する心臓マクロファージの表現型が心臓領域間で異なるかどうかは完全にはわかっていません。しかし、組織微小環境が組織マクロファージの転写および増殖再生に影響を及ぼし得る^{ことが示されている4}。さらに、心筋細胞の表現型は領域間で異なることが実証されているため、マクロファージの心筋細胞に対する機能的影響も、マクロファージ表現型自体が同じであっても、領域特異的であり得る。したがって、特定の心臓領域に関するさらなる研究が必要です。

最近の研究では、定常状態では、組織常在マクロファージが出生前に確立され、確定的な造血とは無関係に発生し、成人期まで持続することが示されています⁵。しかし、マクロファージ枯渇後または心臓炎症中に、Ly6c^hi単球は心臓マクロファージ集団⁶の補充に寄与する。遺伝的系統追跡、パラビオシス、運命マッピング、および細胞追跡を含む研究は、臓器や組織にさまざまな組織常在マクロファージ集団が共存していること、および個体発生に関連する可能性のあるマクロファージサブセットの異なる細胞挙動を示しました^7,8,9。

常在する心臓マクロファージの特性評価は、磁気活性化細胞選別(MACS)および蛍光活性化細胞選別の使用から恩恵を受けています。これらの方法は、細胞表面マーカーで標識することにより、複数の組織画分から特定の細胞集団を単離するのに特に有用です。これにより、単離された免疫細胞型の純度が高くなるだけでなく、表現型分析も可能になります。ここでは、磁気ビーズでコーティングされた細胞とそれに続く、SANおよびAVN領域から特異的に分離された心臓常在マクロファージの濃縮のための蛍光活性化細胞ソーティングを含むプロトコルを紹介します。

伝導系における心臓常在マクロファージの特徴と、心臓伝導や不整脈形成に対するその機能を探索するためには、SANとAVNの正確な局在と解剖が重要です。SANおよびAVNの微小解剖のために、解剖学的ランドマークが領域識別¹⁰に使用される。簡単に言うと、SANは上大静脈と右心房の接合部に位置しています。AVNは、三尖弁の中隔リーフレットによって前方に隣接し、後方にトダロ¹¹の腱によって囲まれているコッホの三角形内に位置しています。また、組織学および免疫蛍光染色によって確認されるマウスのSANおよびAVNの正確なマイクロ解剖手順を提供します。

単離された常在マクロファージは、RNAシーケンシングなどのさらなる実験に使用したり、回収して2週間以上培養したりして、さまざまなin vitro実験を行うことができます。したがって、私たちのプロトコルは、免疫リズム学者にとって非常に価値のある手順を説明しています。 表 1は、必要なすべてのソリューションの構成を示し、 図1 は、SANとAVNのマイクロダイセクションのランドマークを示しています。 図2は、SANとAVNのローカリゼーションの概略 図 です。 図3 は、SANおよびAVNの組織学的染色(マッソントリクロームおよび免疫蛍光染色)を示す。 図4 は、蛍光活性化細胞選別によって心臓常在マクロファージを単離するための段階的なゲーティング戦略を示す。

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プロトコル

動物の世話とすべての実験手順は、ミュンヘン大学の動物の世話と倫理委員会のガイドラインに従って行われ、マウスで行われたすべての手順は、ドイツのミュンヘンにあるバイエルン州政府によって承認されました。C57BL6/Jマウスを商業的に入手した。

1. 事前準備

1. セルソーティングバッファー(表1)を調製し、4°Cで保存します。
   注:実験手順全体を通して、セルソーティングバッファーは常に氷上にある必要があります。
2. 消化の直前に消化バッファー(表1)を調製すると、コラゲナーゼの活性は室温で数時間しか検出できませんでした。
3. 解剖皿¹⁰の準備については、以前に公開されたプロトコルを参照してください。簡単に言うと、直径100 mmのペトリ皿に30 mLのアガロースゲル(3%-4%)を加え、室温で冷却します。

2.動物の犠牲と心臓の切除

1. マウスをイソフルラン気化器に接続されたインキュベーションチャンバーに入れ、5%イソフルラン/ 95%酸素で洗い流して、イソフルランでマウスを麻酔します。
2. 鎮痛のためにフェンタニルを注射した後、胸郭を開き、5〜10mLの氷冷1x PBSを左心室(LV)に直接注射して心臓に灌流します。マウスの心臓を抽出し、解剖皿に置きます。実験の詳細は^{、以前に詳細に説明した10}。

3. SANとAVNのマイクロダイセクション

1. 心臓を分離した後、解剖顕微鏡下で氷冷した1x PBSを使用して解剖皿で以下の微小解剖手順を実行します。
2. 心臓の解剖学的ランドマーク、すなわち、大動脈、肺動脈、冠状動脈洞、左/右心室などを使用します。心臓の左/右(左:LV、右:RV)および前方/後部(前部:大動脈、後部:冠状動脈洞)を決定します。向きが決まったら、皿の底に心臓の前面を置いて心臓の周りを回します(後方にある大きな静脈を露出させるため)。
3. SANのマイクロダイセクション
   注:SANのマイクロダイセクションについては、以前に説明しました¹⁰。このプロセスについては、以下で簡単に説明します。
   1. 右心房付属器(RAA)と上大静脈(SVC)および下大静脈(IVC)に隣接する組織を昆虫ピンを使用して微小解剖皿に固定することにより、阜間領域を露出させます。
   2. クリスタ終末(CT)と平行な心房中隔に沿って心臓を切断し、空洞間領域を分離し、SANサンプルを取得します(図1A、 図2A)。サンプルを氷上の空の1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
4. AVNのマイクロダイセクション
   1. SANサンプルの収集後、RAAと右心房(RA)の一部がすでに切り取られ、心房中隔(IAS)と心室中隔(IVS)のみが残っていることを確認します。
   2. IASとIVSに隣接する組織を通して心臓の残りの部分を昆虫ピンを使用してピンで留め、IASの右側を上向きにします。
   3. コッホの三角形の心内膜表面の右心房を見てください。前方は三尖弁(TV)の中隔リーフレットのヒンジラインで囲まれ、後方はトダロの腱に囲まれます。冠状静脈洞の開口部は基部で観察される。(図1B、図2B)。
   4. AVNを含むコッホの三角形を切り取り、氷上の空の1.5 mLマイクロ遠心チューブに直接入れます。

4.消化

1. 使用直前に消化バッファー(表1)を準備します。
2. SANとAVNの組織をメスでよくミンチします。
   注:組織をよく細かく刻むと、消化効率が向上し、選別に適した細胞懸濁液を得るのに役立ちます。SANおよびAVNサンプルは非常に小さいため、サンプルの損失を減らすために、1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で組織を直接ミンチすることをお勧めします。
3. サンプルあたり500 μLの消化バッファーを加え、1.5 mLマイクロ遠心チューブの壁からすべてのミンチ組織を洗い流します。穏やかなピペッティングは、サンプルの消化に役立ちます。
4. ボルテックスマシンでチューブを均質化します(設定:37°C、750rpmで1時間)。
5. 消化後、40 μmの細胞ストレーナーを通過させて、組織懸濁液を新しい15 mL遠沈管に移します。追加の5 mLのセルソーティングバッファーでセルストレーナーをすすぎ、消化を停止します。
6. 15 mLチューブを350 x g で4°Cで7分間遠心分離します。 その後、ピペットを使用して上清を完全に除去します。細胞ペレットを90 μLのセルソーティングバッファーで再懸濁します。
   注:磁気分離の前に、細胞懸濁液を数回穏やかにピペットで固定するか、必要に応じて30 μmの細胞ストレーナーを通過させて細胞塊を除去し、興味深い細胞集団の磁気濃縮の最適な性能を得るための単一細胞懸濁液を取得します。

5. CD45の磁気濃縮とサンプル染色

注:高い選別効率で心臓マクロファージを単離するために、リンパ球を含む望ましくない細胞の排除は、メーカーのプロトコルに従ってCD45マイクロビーズで行われました。ソーティングパネルに基づいて、心臓常在マクロファージは、CD45高CD11b高CD64^高Ly6C^低/intF4/80^高として同定された。

1. 15 mL遠沈管内の細胞懸濁液に、合計10⁷ 細胞あたり10 μLのCD45マイクロビーズを追加します。サンプルをよく混合し、4°Cで15分間インキュベートします。
   注:血球計算盤を使用した細胞カウントは、各チューブに合計10⁷ 個以下の細胞が含まれていることを確認するために簡単に行う必要があります。より高いセル数で作業する場合は、磁気ビーズの体積を拡大する必要があります。
2. 以下の抗体をセルソーティングバッファーで希釈して抗体混合物を調製します(各抗体について1:100希釈):CD45-PE、CD11b-APC-Cy7、CD64-APC、F4/80-PE-Cy7、Ly6C-FITC。DAPIは、生死識別のために染色に後で追加されます。
3. 15分間の磁気ビーズインキュベーション後、100 μLの抗体混合物を15 mLチューブ内の細胞懸濁液に直接加え(すべての抗体の最終濃度は1:200になります)、4°Cで20分間インキュベートします。
4. 抗体インキュベーションの20分後、10⁷ 細胞あたり1〜2 mLのセルソーティングバッファーを加えて細胞懸濁液を洗浄し、350 x g で10分間遠心分離します。ピペッティングで上清を完全に除去します。
5. 最大 10⁸ 個の細胞を 500 μL のセルソーティングバッファーに再懸濁します。
   注意: 磁気分離の最大セル数は、製造元のプロトコルに従って決定する必要があります。
6. 磁気分離セットを準備します。
   1. 磁気カラムを適切な磁気分離器に取り付け、磁気カラムの下に収集チューブを配置します。
   2. セルソーティングバッファーですすいで磁気カラムを調製します:カラムの上部に500 μLのセルソーティングバッファーを加え、バッファーを通過させます。
7. 細胞ソーティングバッファーが通過している間に、細胞懸濁液を直ちにカラムに塗布します。
   注意: カラムに気泡が形成されないようにしてください。メーカーのプロトコルに従って、カラムの充填時間は保管条件によって変わる可能性がありますが、分離の品質には影響しません。
8. 3 x 500 μLセルソーティングバッファーでカラムを洗浄します。ステップ5.7およびステップ5.8のフロースルーには非標識細胞が含まれており、それ以上の実験が必要ない場合は廃棄できます。
   注:カラムリザーバーがほぼ空になったら、すぐにセルソーティングバッファーを追加します。
9. 磁気分離器からカラムを取り外し、新しい収集チューブに置きます。
10. 1 mL のセルソーティングバッファーをカラムに加えます。カラムに付属のプランジャーをしっかりと当てて、すぐにカラムを洗い流してください。フロースルーには、磁気的に標識されたセルが含まれています。
11. DAPI溶液を、セルソーターで実行する直前に、収集されたすべての磁気標識セル懸濁液に追加します。DAPIの最終濃度を0.3〜0.5μg / mLに調整します。
12. FACS 分析を実行します。

6. 補償のためのサンプル

1. 抗体を光から保護するために、それぞれ「PE」、「APC-Cy7」、「APC」、「PE-Cy7」、「FITC」、および「DAPI」とラベル付けされた6本の茶色の1.5 mLマイクロ遠心チューブを準備します。「未染色」とラベル付けされたもう1本の1.5 mLマイクロ遠心チューブを準備します。
   注:これは、マイクロビーズおよび抗体を含む細胞懸濁液をインキュベートするのと同時に行うことができます。染色されていないサンプルは、温存心臓組織からランダムに収集された心筋細胞組織であり、ステップ4に従って処理することもできます。
2. 蛍光標識抗体をセルソーティングバッファーでそれぞれ1:50に希釈し、それに応じてマークを付けた1.5 mLの茶色の微量遠心チューブに入れます。
3. 補正ビーズ溶液を1滴加え、4°Cで20分間インキュベートします。
4. 2 mLのセルソーティングバッファーを各1.5 mLの茶色の微量遠心チューブに加え、450 x g で5分間遠心分離します。上清を完全に廃棄し、ビーズ入りペレットを300 μLのセルソーティングバッファーで再懸濁し、それに応じてマークされたセルソーターチューブに移します。

7.セルソーターとゲーティング戦略での実行

1. 最初に染色されていないサンプルと補正チューブを塗布し、各チャンネルの電圧を調整して、正と負の両方のピークを軸の適切な位置に合わせます。補正設定を保存し、次のサンプルに適用します。
2. セルソーターでサンプルを塗布します。図 4 の説明に従ってゲーティング戦略を設定します。心臓常在マクロファージは、CD45高CD11b高CD64^高Ly6C^低/intF4/80^高として同定される。DAPIは細胞生存率マーカーとして使用されます。
3. フローサイトメトリーチャートをチェックして、目的の細胞集団がチャートに正しく表示されていることを確認します。そうでない場合は、各チャンネルの電圧を各チャートの中央ビューに調整します。
4. 電圧設定が満足のいく場合は、ソート手順を開始します。選別された細胞集団を、10%ウシ胎児血清を含むDMEMで構成され、100 μg/mLのストレプトマイシンと100 U/mLのペニシリンを添加した培養培地に収集します。

8.常在マクロファージ培養

1. 選別されたマクロファージを集めたら、すぐに細胞を35 mm組織培養皿または24ウェルプレートに移すか、その後の実験に直接使用します。
2. 選別されたマクロファージを培養するために、細胞を37°C、5%_CO2 インキュベーターでインキュベートする。
3. 48〜72時間ごとに培地を交換してください。浮遊死細胞は培地交換により容易に除去することができる。培養皿の底に付着した生きたマクロファージをその後の実験に使用します。

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結果

心臓常在型マクロファージを特にSANおよびAVN領域から単離するための実用的な手順について説明します。正しい解剖を確認するために、マッソントリクローム染色と免疫蛍光HCN4染色が行われます(図3)¹²。このプロトコルでは、1つの心臓全体から約60,000のマクロファージを収集できました。図4は、心臓マクロファージを選別する?...

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ディスカッション

この原稿では、SANおよびAVN領域から特異的に心臓常在マクロファージを高純度で濃縮するためのプロトコルについて説明します。

マクロファージは、解剖学的位置と機能的表現型に基づいて亜集団に分けられます。それらはまた、可変微小環境信号に応答して、ある機能的表現型から別の機能的表現型に切り替えることができる¹³。骨髄や肝臓などの他...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories