15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

Resumen

Aquí, se proporciona una descripción detallada del protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de perfiles de dispersión de relajación ^{de 15}N por solución de espectroscopia de RMN.

Resumen

La dinámica conformacional de proteínas juega un papel fundamental en la regulación de la catálisis enzimática, la unión de ligandos, el alosterismo y la señalización, que son procesos biológicos importantes. Comprender cómo el equilibrio entre la estructura y la dinámica gobierna la función biológica es una nueva frontera en la biología estructural moderna y ha encendido varios desarrollos técnicos y metodológicos. Entre estos, los métodos de RMN de la solución de dispersión de relajación de CPMG proporcionan información única de resolución atómica sobre la estructura, cinética y termodinámica de los equilibrios conformacionales de proteínas que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms. Aquí, el estudio presenta protocolos detallados para la adquisición y el análisis de un experimento de dispersión de relajación de ¹⁵N. Como ejemplo, se muestra la tubería para el análisis de la dinámica μs-ms en el dominio C-terminal de la enzima I.

Introducción

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) experimentos de dispersión de relajación (RD) se utilizan sobre una base de rutina para caracterizar los equilibrios conformacionales que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms por solución espectroscopia de RMN^1,2,3,4,5. En comparación con otros métodos para la investigación de la dinámica conformacional, las técnicas de CPMG son relativamente fáciles de implementar en los espectrómetros de RMN modernos, no requieren pasos especializados de preparación de muestras (es decir, cristalización, congelación o alineación de muestras, y / o conjugación covalente con una etiqueta fluorescente o paramagnética), y proporcionan una caracterización completa de los equilibrios conformacionales que devuelven información estructural, cinética y termodinámica sobre los procesos de intercambio. Para que un experimento de CPMG informe sobre un equilibrio conformacional, se deben aplicar dos condiciones: (i) los espines de RMN observados deben poseer diferentes cambios químicos en los estados sometidos a intercambio conformacional (microestados) y (ii) el intercambio tiene que ocurrir en una escala de tiempo que va de ~50 μs a ~10 ms. En estas condiciones, la tasa de relajación transversal observada ( ) es la suma del_R2 intrínseco (el_R2 medido en ausencia de dinámica de μs-ms, ) y la contribución de intercambio a la relajación transversal (R_ex). La contribución de R_ex a_R2^obs se puede apagar progresivamente reduciendo el espaciamiento entre los pulsos de 180° que constituyen el bloque CPMG de la secuencia de pulsos, y las curvas de RD resultantes se pueden modelar utilizando la teoría de Bloch-McConnell para obtener la diferencia de desplazamiento químico entre microestados, la población fraccionaria de cada microestado y las tasas de intercambio entre microestados(Figura 1),^1,2,3.

Varias diversas secuencias del pulso y protocolos del análisis se han divulgado en la literatura para ¹⁵experimentos de N CPMG. Adjunto, el protocolo puesto en ejecución en el laboratorio se describe. En particular, se introducirán los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la configuración y adquisición de los experimentos de RMN, y el procesamiento y análisis de los datos de RMN (Figura 2). Para facilitar la transferencia del protocolo a otros laboratorios, el programa de pulsos, los scripts de procesamiento y análisis y un conjunto de datos de ejemplo se proporcionan como archivos suplementarios y están disponibles para su descarga en (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La secuencia de pulsos proporcionada incorpora un ciclo de fase de cuatro pasos en el bloque CPMG para la supresión de artefactos dependientes de desplazamiento⁶ y está codificada para la adquisición de varios experimentos intercalados. Estos experimentos intercalados tienen un período de relajación idéntico pero diferentes números de pulsos de reenfoque para lograr diferentes campos^{cpmg 7.} También es importante notar que el programa de impulsos descrito mide los ¹⁵N _R2 de la componente TROSY de la señal de RMN^8. En general, el protocolo se ha aplicado con éxito para la caracterización del intercambio conformacional en proteínas de tamaño mediano y grande^4,5,9,10. Para sistemas más pequeños (<20 kDa), se recomienda el uso de una secuencia de pulsos^{heteronuclear}basada en coherencia cuántica única (HSQC)^{11, 12.}

Protocolo

1. Preparación de la muestra de RMN

1. Expresar y purificar una muestra ^{de 2}H,¹⁵N-labled de la proteína de interés.
   NOTA: Mientras que una muestra de proteína ¹⁵con etiqueta N se puede utilizar para la adquisición del experimento CPMG RD, la perdeuteración (cuando sea posible) aumenta dramáticamente la calidad de los datos obtenidos. Los protocolos para la producción de proteínas perdeuteradas están disponibles en la literatura¹³.
2. Intercambio del almacenador intermediario la muestra purificada de la proteína en un almacenador intermediario desgastado del RMN.
3. Transfiera la muestra de RMN al tubo de RMN.
   NOTA: La concentración de la muestra de RMN debe optimizarse cuidadosamente para maximizar la relación señal-ruido y minimizar la aparición de interacciones proteína-proteína. En general, el rango de concentración típico para los experimentos de CPMG es de 0.1-1.0 mM.

2. Primera puesta a día del experimento de RMN

1. Descargue y descomprima los archivos suplementarios.
2. Copie los archivos bits.vv y trosy_15N_cpmg.vv (ubicados en la carpeta denominada pulseprogram) en el directorio del programa pulse (
3. Abra el software de adquisición y copie un experimento HSQC ^previamenteejecutado de 1 H-¹⁵N en un nuevo experimento utilizando el comando edc.
4. Usando el comando pulprog, cargue el programa de pulsos trosy_15N_cpmg.vv en el experimento recién creado.
5. Configure el experimento CPMG siguiendo las instrucciones proporcionadas al final del archivo de programa de pulsos (trosy_15N_cpmg.vv).

3. Configuración rutinaria del experimento de RMN

1. Introducir la muestra en el imán y realizar todos los pasos básicos para la adquisición de cualquier experimento de RMN: bloquear y caldo la muestra; coincide y sintoniza los canales ¹H y ¹⁵N.
2. Fije p1 y p7 a la duración de los pulsos duros de 90° de ¹H y ¹⁵N, respectivamente.
   NOTA: Para obtener resultados óptimos, es importante calibrar el pulso ^{de 15}N 90° con mucho cuidado. La calibración se logra generalmente usando una muestra de 100 milímetros de urea N-etiquetada ¹⁵en DMSO según lo descrito en el manual del espectrómetro. Además, es posible volver a comprobar la calibración directamente en la muestra de RMN de trabajo adquiriendo el primer incremento de ^unespectro HSQC de 1 H-¹⁵N en el que el pulso de ¹⁵N 90° del primer bloque INEPT se cambia a un pulso de 180°. Si la calibración es correcta, se debe obtener un nulo.
3. En la ventana de adquisición, establezca el centro y el ancho espectral para las dimensiones ¹H y ¹⁵N.
   NOTA: Centre el espectro ^{de 1}H en la frecuencia de la señal de agua para una supresión óptima del agua.
4. Establezca el retardo de relajación (d30) igual a 0.7_T2,donde_T2 es el tiempo de relajación transversal esperado de ¹⁵N de su proteína.
   Nota: El valor de d30 se puede optimizar empíricamente para obtener los mejores resultados.
5. Utilice el comando vclist para crear una lista de números enteros correspondientes al parámetro n en la Figura 1A y la Figura 1B. Asegúrese de que cada entrada de la lista corresponde a un campo CPMG diferente (ν_cpmg) según ν_cpmg = 4 x n / d30. Asegúrese de que el primer número de la lista es 0 (esto corresponde al experimento de referencia para el que se omite el bloque CPMG y d30 = 0 s) y no utilice números mayores que 1.000 x d30 / 4. Los números mayores que este umbral dan como resultado ν_cpmg > 1 kHz y podrían dañar la sonda.
6. Fije l8 al número de entradas en el vclist, l3 al número de puntos verdaderos para la dimensión indirecta (generalmente un rango de 64-200 se fija para l3), y 1 td igual a l8 x l3 x 2.
   NOTA: Realice los pasos 3.7-3.11 para optimizar la supresión de agua.
7. Establezca la ganancia del receptor (rg) en 1; abra el archivo de programa de pulso (edcpul), vaya a la línea 91, quite el punto y coma que precede a goto 999y guarde el archivo.
8. Usando el comando gs ajuste los parámetros spdb0 (o spdw0) para minimizar la intensidad de la señal FID.
9. Vuelva a introducir el punto y coma en la línea 91 del archivo de programa de pulsos y guarde el archivo.
10. Repita los pasos 3.7-3.9 para optimizar spdb11 (línea 168 del archivo de programa de pulsos), spdb2 (línea 179 del archivo de programa de pulsos) y pldb2 (línea 184 del archivo de programa de pulsos).
11. Ejecute el comando rga para optimizar la ganancia del receptor.
12. Establezca el número de exploraciones (ns) en un múltiplo de 8.
13. Ejecute el comando zg para iniciar el experimento.

4. Tratamiento y análisis de los datos de RMN

1. Copie la carpeta denominada Proceso (Archivos suplementarios)en el directorio que contiene el archivo ser.
2. Utilice los archivos sep_fid.com y ft2D.com para procesar los datos de RMN.
   Nota : instrucción en cuanto a cómo editar las secuencias de comandos de procesamiento se proporciona dentro de los archivos de sep_fid.com y ft2D.com.
3. Abra los archivos ucsf contenidos en el directorio CPMG_Sparky_files en Sparky.
   Nota : los archivos ucsf se crean mediante las secuencias de comandos de procesamiento. Hay un archivo ucsf para cada entrada en el vclist. El primer archivo ucsf (test_1.ucsf) contiene el experimento de referencia. Los archivos ucsf posteriores (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) se ordenan del valor más bajo al más grande de ν_cpmg.
4. Elija los picos cruzados de RMN en el espectro de RMN de referencia (test_1.ucsf).
5. Seleccione todos los picos cruzados seleccionados utilizando el comando Sparky pa.
6. Ejecute el comando Sparky rh. Este comando abre una ventana de diálogo. Seleccione las alturas de opción en la misma posición en cada espectro. Haga clic en la configuración y marque todos los espectros nmr. Haga clic en Actualizar y guarde el archivo de salida en el directorio de trabajo. El archivo de salida contiene la matriz de las intensidades de la señal sobre todos los espectros abiertos del RMN.
   NOTA: En la literatura¹⁴se han descrito protocolos más precisos que utilizan el ajuste de forma de línea para recuperar intensidades de experimentos pseudo-3D intercalados. El software disponible gratuitamente para el ajuste de forma de línea está disponible en https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) y dentro de NMRPipe (módulo nLinLS) y SPARKY (módulo it).
7. Para cada campo CPMG, convierta las intensidades de la señal a velocidades_R2 utilizando la fórmula, donde I₀ e I_d30 son la intensidad de los espectros de RMN de referencia (vc = 0) y relajados (vc > 0), respectivamente.
   Nota: En los archivos suplementarios,se proporciona una plantilla del archivo de hoja de cálculo (R2_calc.xls) utilizado para convertir las intensidades de señal a velocidades_R2 y para visualizar los perfiles de RD.
8. Lea el nivel de ruido en el espectro de referencia utilizando el comando sparky st y propague el error en las velocidades_R2.
   Nota : en los archivos suplementarios,se proporciona una plantilla del archivo de hoja de cálculo (R2_calc.xls) utilizado para propagar el error en las tasas de R₂ medidas.

5. Ajuste de curvas RD

1. Copie la carpeta denominada RD_fitting (Archivos suplementarios) en el directorio de trabajo.
2. Para cada pico de RMN asignado, estime R_ex calculando el . y son las tasas R₂ medidas en el ν_cpmg más bajo y más alto en el vclist.
3. Inspeccione visualmente las curvas RD con R_ex mayor que el doble del error estimado y descarte todas las curvas RD que son demasiado ruidosas para ser modeladas con precisión.
   NOTA: El ruido en R_ex se puede propagar a partir de los errores en y .
4. Prepare un fichero de entrada para el script de conexión utilizando todas las curvas RD con R_ex mayor que el doble del error estimado.
   NOTA: Las instrucciones detalladas sobre la preparación de los archivos de entrada se proporcionan dentro de los scripts de ajuste. Los archivos de entrada de ejemplo se proporcionan como archivos suplementarios. Comúnmente, los datos de RD se miden en dos campos estáticos diferentes y se ajustan simultáneamente. En este protocolo, se requieren dos archivos de entrada diferentes (Archivos suplementarios).
5. Ajuste los datos de ESCRITORIO REMOTO mediante los scripts proporcionados en Archivos suplementarios.
   NOTA: Se proporcionan dos secuencias de comandos diferentes para realizar un ajuste basado en residuos o global de las curvas rd, respectivamente. Ambos scripts se ajustan a las curvas de RD utilizando un modelo de intercambio de dos sitios y la ecuación de Carver-Richards. Se proporcionan instrucciones más detalladas dentro de los guiones de conexión. Paquetes de software adicionales como Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) y CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) están disponibles para llevar a cabo el ajuste de datos utilizando las ecuaciones de Block-McConnell.
6. Probar la fiabilidad de los parámetros ajustados estimando la reducción de χ² en función de p_b y k_ex.
   Nota: El χ reducido² se proporciona en el archivo de salida. p_b y k_ex pueden restringirse a valores específicos utilizando límites inferiores y superiores en los procedimientos de ajuste. En nuestros scripts, los límites inferior y superior para p_b son lb(2) y ub(2), respectivamente. Los límites inferior y superior para k_ex son lb(3) y ub(3), respectivamente.
7. Estime el error en los parámetros ajustados. Esto se puede hacer estableciendo el valor de MC_fac en el script en 1 y repitiendo el ajuste varias veces (normalmente >20 repeticiones). El error en cada parámetro se estima como la desviación estándar de la distribución.
   Nota : establecer MC_fac en 1 genera un conjunto de datos sintético en el que se agrega un error distribuido gaussiano (calculado en función del error experimental) a los datos experimentales.

Resultados

El protocolo aquí descrito da como resultado la adquisición de perfiles de DR para cada pico en ^elespectro TROSY de 1^H-15N (Figura 3A). A partir de los perfiles de DR adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de ¹⁵N de cada grupo amida de la columna vertebral (Figura 3A,3B). Trazando el R_ex sobre la estructura 3D de la proteína bajo investigación, e...

Discusión

Este manuscrito describe el protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de ¹⁵N RD de datos sobre proteínas. En particular, se cubren los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la medición de los datos de RMN y el análisis de los perfiles de DR. A continuación se discuten algunos aspectos importantes con respecto a la adquisición y el análisis de experimentos de RD. Sin embargo, para una descripción más profunda del experimento y el análisis de los dato...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	Acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	Acquisition Software