15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

Resumen

Aquí, se proporciona una descripción detallada del protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de perfiles de dispersión de relajación ^{de 15}N por solución de espectroscopia de RMN.

Resumen

La dinámica conformacional de proteínas juega un papel fundamental en la regulación de la catálisis enzimática, la unión de ligandos, el alosterismo y la señalización, que son procesos biológicos importantes. Comprender cómo el equilibrio entre la estructura y la dinámica gobierna la función biológica es una nueva frontera en la biología estructural moderna y ha encendido varios desarrollos técnicos y metodológicos. Entre estos, los métodos de RMN de la solución de dispersión de relajación de CPMG proporcionan información única de resolución atómica sobre la estructura, cinética y termodinámica de los equilibrios conformacionales de proteínas que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms. Aquí, el estudio presenta protocolos detallados para la adquisición y el análisis de un experimento de dispersión de relajación de ¹⁵N. Como ejemplo, se muestra la tubería para el análisis de la dinámica μs-ms en el dominio C-terminal de la enzima I.

Introducción

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) experimentos de dispersión de relajación (RD) se utilizan sobre una base de rutina para caracterizar los equilibrios conformacionales que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms por solución espectroscopia de RMN^1,2,3,4,5. En comparación con otros métodos para la investigación de la dinámica conformacional, las técnicas de CPMG son relativamente fáciles de implementar en los espectrómetros de RMN modernos, no requieren pasos especializa....

Protocolo

1. Preparación de la muestra de RMN

1. Expresar y purificar una muestra ^{de 2}H,¹⁵N-labled de la proteína de interés.
   NOTA: Mientras que una muestra de proteína ¹⁵con etiqueta N se puede utilizar para la adquisición del experimento CPMG RD, la perdeuteración (cuando sea posible) aumenta dramáticamente la calidad de los datos obtenidos. Los protocolos para la producción de proteínas perdeuteradas están disponibles en la literatura¹³.
2. Intercambio del almacenador intermediario la muestra purificada de la proteína en un almacenador intermediario desgastado del RMN.
3. Transfiera la muestra d....

Resultados

El protocolo aquí descrito da como resultado la adquisición de perfiles de DR para cada pico en ^elespectro TROSY de 1^H-15N (Figura 3A). A partir de los perfiles de DR adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de ¹⁵N de cada grupo amida de la columna vertebral (Figura 3A,3B). Trazando el R_ex sobre la estructura 3D de la proteína bajo investigación, e.......

Discusión

Este manuscrito describe el protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de ¹⁵N RD de datos sobre proteínas. En particular, se cubren los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la medición de los datos de RMN y el análisis de los perfiles de DR. A continuación se discuten algunos aspectos importantes con respecto a la adquisición y el análisis de experimentos de RD. Sin embargo, para una descripción más profunda del experimento y el análisis de los dato.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	acquisition software