15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

Summary

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של ¹⁵N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

Abstract

דינמיקה קונפורמציה של חלבונים ממלאת תפקידי יסוד בוויסות קטליזה אנזימטית, כריכת ליגנד, אלוסטריה ואיתות, שהם תהליכים ביולוגיים חשובים. הבנת האופן שבו האיזון בין מבנה לדינמיקה שולט בתפקוד הביולוגי היא גבול חדש בביולוגיה המבנית המודרנית והציתה מספר התפתחויות טכניות ומתודולוגיות. בין אלה, פתרון פיזור הרפיה CPMG שיטות NMR לספק ייחודי, מידע ברזולוציה אטומית על המבנה, קינטיקה, תרמודינמיקה של שיווי משקל קונפורמי חלבון המתרחשים על ציר הזמן μs-ms. כאן, המחקר מציג פרוטוקולים מפורטים לרכישה וניתוח של ניסוי פיזור ^{הרפיה 15}N. כדוגמה, הצינור לניתוח הדינמיקה μs-ms בתחום C-מסוף של אנזים חיידקים אני מוצג.

Introduction

Carr-פרסל Meiboom-Gill (CPMG) הרפיה פיזור (RD) ניסויים משמשים על בסיס שגרתי לאפיון שיווי משקל קונפורמי המתרחשים על ציר הזמן μs-ms על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR^1,2,3,4,5. בהשוואה לשיטות אחרות לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית, טכניקות CPMG קלות יחסית ליישום בספקטרומטרים מודרניים של NMR, אינן דורשות שלבי הכנה מיוחדים לדוגמה (כלומר, התגבשות, הקפאה או יישור מדגם, ו/או הטיה קוולנטית עם תג פלואורסצנטי או פרמגנטי), ומספקות אפיון מקיף של שיווי משקל קונפורמי המחזיר מידע מבני, קינטי ותרמודינמי על תהליכי החלפה. על מנת שניסוי CPMG ידווח על שיווי משקל קונפורמי, יש להחיל שני תנאים: (i) ספינים NMR שנצפו חייבים להחזיק משמרות כימיות שונות במדינות העוברות חילופי קונפורמציה (microstates) ו- (ii) ההחלפה צריכה להתרחש בסולם זמן הנע בין ~ 50 מיקרוס ל ~ 10 אלפיות השנייה. בתנאים אלה, שיעור ההרפיה הרוחבי שנצפה ( ) הוא סכום R₂ המהותי (R₂ נמדד בהעדר דינמיקה μs-ms), ואת תרומת ההחלפה הרפיה רוחבית (R_ex). ניתן להרוותבהדרגה את תרומת R_ex ^לאובס R₂על-ידי הפחתת הריווח בין פולסים של 180° המהווים את בלוק ה- CPMG של רצף הדופק, ואת עקומות המו"פ הנובעות מכך ניתן לעצב באמצעות תיאוריית בלוך-מקונל כדי להשיג את ההבדל הכימי בין מיקרוסטאטים, את אוכלוסיית השברים של כל מיקרוסטאט ואת שיעורי ההחלפה בין מיקרוסטטים (איור¹).

מספר רצפי דופק שונים ופרוטוקולי ניתוח דווחו בספרות עבור ¹⁵ניסויי N CPMG. להלן מתואר הפרוטוקול המיושם במעבדה. בפרט, יוכנסו השלבים המכריעים להכנת מדגם NMR, הקמה ורכישה של ניסויי NMR, ועיבוד וניתוח של נתוני NMR (איור 2). כדי להקל על העברת הפרוטוקול למעבדות אחרות, תוכנית הדופק, סקריפטים עיבוד וניתוח, ו ערכת נתונים אחת לדוגמה מסופקים כקבצים משלימים זמינים להורדה ב (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). רצף הדופק שסופק משלב מחזור פאזה בן ארבעה שלבים בבלוק CPMG לדיכוי חפצים תלויי אופסט⁶ והוא מקודד לרכישת מספר ניסויים שזורים. ניסויים אלה interleaved יש תקופת הרפיה זהה אבל מספר שונה של פולסים מיקוד מחדש על מנת להשיג שדות CPMG שונים⁷. חשוב גם לשים לב כי תוכנית הדופק המתוארת מודדת את ¹⁵N R₂ של רכיב TROSY של אות NMR⁸. בסך הכל, הפרוטוקול הוחל בהצלחה על אפיון חילופי קונפורמציה בחלבונים בינוניים וגדולים^4,5,9,10. עבור מערכות קטנות יותר (<20 kDa), מומלץ להשתמש בקוהרנטיות קוונטית אחת הטרונוקלארית (HSQC) המבוססת על^{פולסים 11,12.}

Protocol

1. הכנת מדגם NMR

1. לבטא ולטהר ²H,¹⁵N-labled מדגם של החלבון של עניין.
   הערה: בעוד שמדגם חלבון בעל תווית N ¹⁵יכול לשמש לרכישת ניסוי CPMG RD, התייבשות (במידת האפשר) מגדילה באופן דרמטי את איכות הנתונים המתקבלים. פרוטוקולים לייצור חלבונים מיובשים זמינים בספרות¹³.
2. חוצץ להחליף את דגימת החלבון המטוהר לתוך מאגר NMR degassed.
3. העבר את דגימת NMR לתוך צינור NMR.
   הערה: יש למטב בזהירות את הריכוז של דגימת NMR על מנת למקסם את יחס האות לרעש ולמזער את התרחשותן של אינטראקציות חלבון-חלבון. באופן כללי, טווח הריכוז האופייני לניסויי CPMG הוא 0.1-1.0 מ"מ.

2. הגדרה ראשונה של ניסוי NMR

1. הורד ובטל את ההסתעפות של הקבצים המשלימים.
2. העתק את הקבצים bits.vv ו- trosy_15N_cpmg.vv (הממוקמים בתיקיה בשם pulseprogram) לספריית תוכניות הדופק (<פת>/exp/stan/nmr/רשימות/עמ'/משתמש).
   הערה: ודא שהנתיב ל- bits.vv המפורט בשורה הראשונה של הקובץ trosy_15N_cpmg.vv נכון.
3. פתח תוכנת רכישה והעתק ניסוי ^H-15N HSQC שנערך בעבר לניסוי חדש באמצעות הפקודה edc.
4. באמצעות pulprogהפקודה , לטעון את תוכנית הדופק trosy_15N_cpmg.vv לתוך הניסוי החדש שנוצר.
5. הגדר את ניסוי CPMG באמצעות ההוראות שסופקו בסוף קובץ תוכנית הדופק (trosy_15N_cpmg.vv).

3. הקמה שגרתית של ניסוי NMR

1. הציגו את המדגם במגנט ובצעו את כל השלבים הבסיסיים לרכישת כל ניסוי NMR: נעלו ושימו את הדגימה; להתאים ולכוונן את ¹H ו ¹⁵N ערוצים.
2. הגדר p1 ו p7 למשך של ¹H ו ¹⁵N קשה 90° פולסים, בהתאמה.
   הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, חשוב לכייל את הדופק של ¹⁵N 90° בזהירות רבה. כיול מושגת בדרך כלל באמצעות מדגם 100 מ"מ של ¹⁵אוריאה N-labeled ב DMSO כמתואר במדריך ספקטרומטר. בנוסף, ניתן לבדוק שוב את הכיול ישירות על דגימת NMR העובדת על ידי רכישת ההפרש הקבוע הראשון של ספקטרום ^H-15N HSQC שבו הדופק ^{של 15}N 90° של בלוק INEPT הראשון עובר לפולס של 180°. אם הכיול נכון, יש להשיג Null.
3. בחלון הרכישה, הגדר את הרוחב המרכזי והספקטרלי עבור הממדים ¹H ^{ו- 15}N.
   הערה: מרכז את הספקטרום ¹H בתדר של אות המים לדיכוי מים אופטימלי.
4. הגדר את השהיית הרפיה (d30) שווה 0.7 T₂, שבו T₂ הוא צפוי ¹⁵N זמן הרפיה רוחבי של החלבון שלך.
   הערה: ניתן למטב את הערך של d30 באופן אמפירי כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
5. השתמש ברשימת vclist של הפקודות כדי ליצור רשימה של מספרים שלמים התואמים לפרמטר n באיור 1A ובאיור 1B. ודא שכל ערך ברשימה מתאים לשדה CPMG אחר (ν_cpmg)בהתאם ל- ν_cpmg = 4 x n / d30. ודא שהמספר הראשון ברשימה הוא 0 (פעולה זו תואמת לניסוי ההפניה שעבורו מדלגים על בלוק CPMG ו- d30 = 0 s) ולא להשתמש במספרים הגדולים מ- 1,000 x d30 / 4. מספרים הגדולים מסף זה גורמים ל- ν_cpmg > 1 kHz ועלולים לגרום נזק לבדיקה.
6. הגדר את l8 למספר הערכים ברשימת ה- vclist, l3 למספר הנקודות הממשיות עבור הממד העקיף (בדרך כלל טווח של 64-200 מוגדר עבור l3) ו- 1 td שווה ל- l8 x l3 x 2.
   הערה: בצע את השלבים 3.7-3.11 כדי למטב את דיכוי המים.
7. הגדר את רווח המקלט (rg) ל- 1; פתח את קובץ תוכנית הדופק (edcpul), עבור לקו 91, הסר את הנקודה-פסיק שלפני goto 999ושמור את הקובץ.
8. באמצעות הפקודה gs להתאים את הפרמטרים spdb0 (או spdw0) על מנת למזער את עוצמת אות FID.
9. הצג מחדש את הנקודה-פסיק בשורה 91 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ.
10. חזור על השלבים 3.7-3.9 כדי לייעל spdb11 (שורה 168 של קובץ תוכנית הדופק), spdb2 (שורה 179 של קובץ תוכנית הדופק), ו pldb2 (שורה 184 של קובץ תוכנית הדופק).
11. הפעל את הפקודה rga כדי למטב את רווח המקלט.
12. הגדר את מספר הסריקות (ns)לכפולה של 8.
13. הפעל את הפקודה zg כדי להתחיל בניסוי.

4. עיבוד וניתוח של נתוני NMR

1. העתק את התיקיה בשם Process (קבצים משלימים) לספריה המכילה את קובץ ser.
2. השתמש בקבצים sep_fid.com ft2D.com כדי לעבד את נתוני NMR.
   הערה: הוראה כיצד לערוך את קבצי ה- Script לעיבוד מסופקת בתוך קבצי sep_fid.com והקבצים ft2D.com.
3. פתח את קבצי ucsf הכלולים בספריה CPMG_Sparky_files בספרקי.
   הערה: קבצי ucsf נוצרים על-ידי קבצי ה- Script של העיבוד. יש קובץ ucsf אחד עבור כל ערך ברשימת ה- vclist. קובץ ה- ucsf הראשון (test_1.ucsf) מכיל את ניסוי הייחוס. קבצי ucsf הבאים (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) מסודרים מהנמוך ביותר לערך הגדול ביותר של ν_cpmg.
4. בחר את הפסגות הצולבות של NMR בספקטרום NMR הייחוס (test_1.ucsf).
5. בחר את כל הפסגות הצולבות שנבחרו באמצעות הרשותלפקודה Sparky .
6. הפעל את הפקודהספרקי rh . פקודה זו פותחת חלון דו-שיח. בחר את גובה האפשרויות באותו מיקום בכל ספקטרום. לחץ על ההתקנה ובדוק את כל ספקטרום NMR. לחץ על עדכן ושמור את קובץ הפלט בספריית העבודה. קובץ הפלט מכיל את המטריצה של עוצמות האות מעל כל ספקטרום NMR שנפתח.
   הערה: פרוטוקולים מדויקים יותר המשתמשים התאמת lineshape לשחזור עוצמות מניסויים פסאודו-3D שזורים תוארו בספרות¹⁴. תוכנה זמינה בחופשיות להתאמת lineshape זמינה https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), ובתוך NMRPipe (מודול nLinLS) ו SPARKY (מודול זה).
7. עבור כל שדה CPMG, המר את עוצמת האותות לקצבי R₂ באמצעות הנוסחה , כאשר I₀ ו- I_d30 הם עוצמת ההפניה (vc = 0) וספקטרום NMR רגוע (vc > 0), בהתאמה.
   הערה: בקבצים המשלימים, מסופקת תבנית של קובץ הגיליון האלקטרוני (R2_calc.xls) המשמש להמרת עוצמת האותות לתעריפי R₂ ולהמחיש את פרופילי המו"פ.
8. קרא את רמת הרעש בספקטרום ההפניות באמצעות הפקודה Sparky st והפץ את השגיאה בשיעורי R_2.
   הערה: בקבצים המשלימים, מסופקת תבנית של קובץ הגיליון האלקטרוני (R2_calc.xls) המשמש להפצת השגיאה בשיעורי R₂ הנמדדים.

5. התאמת עקומות RD

1. העתק את התיקיה בשם RD_fitting (קבצים משלימים) לספריית העבודה.
2. עבור כל שיא NMR שהוקצה, להעריך R_ex על ידי חישוב .
3. בדוק באופן חזותי את עקומות המו"פ עם R_ex גדול מפי שניים מהשגיאה המשוערת והשליך את כל עקומות המו"פ הרועשים מכדי שניתן יהיה לדגמן במדויק.
   הערה: רעש על R_ex ניתן להפיץ מן השגיאות על ו .
4. הכן קובץ קלט עבור קובץ ה- Script המתאים באמצעות כל עקומות המו"פ עם R_ex הגדול מפי שניים מהשגיאה המשוערת.
   הערה: הוראה מפורטת על הכנת קבצי הקלט מסופקים בתוך הסקריפטים המתאימים. קבצי קלט לדוגמה מסופקים כקבצים משלימים. בדרך כלל, נתוני המו"פ נמדדים בשני שדות סטטיים שונים ומותאמים בו-זמנית. בפרוטוקול זה נדרשים שני קבצי קלט שונים (קבצים משלימים).
5. התאם את נתוני ה- RD באמצעות קבצי ה- Script הכלולים בקבצים משלימים.
   הערה: שני סקריפטים שונים מסופקים לביצוע התאמה מבוססת שאריות או התאמה גלובלית של עקומות המו"פ, בהתאמה. שני התסריטים מתאימים לעקומות ה-RD באמצעות מודל חילופי שני אתרים ומשוואת קארבר-ריצ'רדס. הוראות מפורטות יותר ניתנות בתוך הסקריפטים המתאימים. חבילות תוכנה נוספות כגון Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) ו- CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) זמינות לביצוע התאמת נתונים באמצעות משוואות בלוק-מקונל.
6. בדוק את המהימנות של הפרמטרים המותאמים להערכת χ^{המופחת 2} כפונקציה של p_b ו- k_ex.
   הערה: χ^{המופחת 2} מסופק בקובץ הפלט. p_b ו- k_ex ניתן לרסן לערכים ספציפיים באמצעות הגבולות התחתונים והעליון בהליכי ההתאמה. בתסריטים שלנו, הגבולות התחתונים והעליון עבור p_b הם lb(2) ו- ub(2), בהתאמה. הגבולות התחתונים והעליון עבור k_ex הם lb(3) ו- ub(3), בהתאמה.
7. הערכת השגיאה בפרמטרים המותאמים. ניתן לעשות זאת על ידי הגדרת הערך של MC_fac בקובץ ה- Script ל- 1 וחזרה על ההתאמה מספר פעמים (בדרך כלל >20 חוזר). השגיאה בכל פרמטר מוערכת כסטיית התקן של ההתפלגות.
   הערה: הגדרת MC_fac ל- 1 יוצרת ערכת נתונים סינתטית שבה שגיאה מבוזרת של גאוסיאני (המחושבת בהתבסס על השגיאה הניסיונית) מתווספת לנתונים הניסיוניים.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מביא לרכישת פרופילי RD עבור כל שיא בספקטרום ¹H-¹⁵N TROSY (איור 3A). מפרופילי המו"פ הנרכשים ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לרגיעה רוחבית של ¹⁵N של כל קבוצת אמידה(איור 3A, 3B). על ידי התוויית R_ex על המבנה 3D של החלבון תחת חקי?...

Discussion

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המיושם במעבדה לרכישה וניתוח של ¹⁵נתוני N RD על חלבונים. בפרט, השלבים הקריטיים להכנת מדגם NMR, מדידת נתוני NMR וניתוח פרופילי המו"פ מכוסים. להלן כמה היבטים חשובים לגבי רכישה וניתוח של ניסויי מו"פ נדונים. עם זאת, לתיאור מעמיק יותר של הניסוי וניתוח הנתונים, מומלץ מאו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	acquisition software