15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

Resumo

Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de ¹⁵N por espectroscopia de solução NMR.

Resumo

A dinâmica conformacional proteica desempenha papéis fundamentais na regulação da catálise enzimática, ligação de ligantes, aosteria e sinalização, que são importantes processos biológicos. Entender como o equilíbrio entre estrutura e dinâmica rege a função biológica é uma nova fronteira na biologia estrutural moderna e tem inflamado diversos desenvolvimentos técnicos e metodológicos. Entre estes, os métodos NMR da solução de relaxamento cpmg fornecem informações únicas de resolução atômica sobre a estrutura, cinética e termodinâmica do equilíbrio conformacional proteico que ocorre na escala de tempo μs-ms. Aqui, o estudo apresenta protocolos detalhados para aquisição e análise de um experimento de dispersão de relaxamento de ¹⁵N. Como exemplo, o pipeline para a análise da dinâmica μs-ms no domínio terminal C da bactéria Enzima I é mostrado.

Introdução

Os experimentos de dispersão de relaxamento (RD) Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) são usados em uma base de rotina para caracterizar o equilíbrio conformacional que ocorre na escala de tempo μs-ms por solução espectroscopia NMR^1,2,3,4,5. Em comparação com outros métodos de investigação da dinâmica conformacional, as técnicas de CPMG são relativamente fáceis de implementar em espectrômetros de RN modernos, não exigem etapas especializadas de preparação de amostras (ou seja, cristalização, congelamento ou alinhamento de amostras e/ou conjugação codinâmica com uma etiqueta fluorescente ou paramagnética), e fornecem uma caracterização abrangente do equilíbrio conformacional retornando informações estruturais, cinéticas e termodinâmicas em processos de troca. Para que um experimento cpmg informe sobre um equilíbrio conformacional, duas condições devem ser aplicadas: (i) as rodadas de RMN observadas devem possuir diferentes mudanças químicas nos estados submetidos à troca conformacional (microestados) e (ii) a troca deve ocorrer em uma escala de tempo que varia de ~50 μs a ~10 ms. Nessas condições, a taxa de relaxamento transversal observada é a soma do R₂ intrínseco (o R₂ medido na ausência de dinâmica μs-ms) e a contribuição cambial para o relaxamento transversal (R_ex). A contribuição_{R ex} para R₂^obs pode ser progressivamente saciada reduzindo o espaçamento entre os pulsos de 180° que constituem o bloco CPMG da sequência de pulso, e as curvas RD resultantes podem ser modeladas usando a teoria Bloch-McConnell para obter a diferença de mudança química entre os microestados, a população fracionária de cada microestado, e as taxas de troca entre microestados (Figura 1)^1,2,3.

Várias sequências de pulso diferentes e protocolos de análise foram relatados na literatura para ^{experimentos de 15}N CPMG. Aqui, o protocolo implementado no laboratório é descrito. Em particular, serão introduzidas as etapas cruciais para a elaboração da amostra de RMN, a configuração e aquisição dos experimentos de RMN e o processamento e análise dos dados da RMN(Figura 2). Para facilitar a transferência do protocolo para outros laboratórios, o programa de pulso, scripts de processamento e análise e um exemplo de conjunto de dados são fornecidos como Arquivos Suplementares e estão disponíveis para download em (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). A sequência de pulso fornecida incorpora um ciclo de fase de quatro etapas no bloco CPMG para supressão de artefatos dependentes de deslocamento⁶ e é codificada para aquisição de vários experimentos intercalados. Esses experimentos intercalados têm um período de relaxamento idêntico, mas números diferentes de pulsos de refoco, a fim de alcançar diferentes campos CPMG⁷. Também é importante notar que o programa de pulso descrito mede o ¹⁵N R₂ do componente TROSY do sinal NMR⁸. No geral, o protocolo foi aplicado com sucesso para a caracterização da troca conformacional em proteínas de médio e grande porte^4,5,9,10. Para sistemas menores (<20 kDa), o uso de uma sequência de pulso baseada em Coerência Quântica Única Heteronuclear (HSQC)^é aconselhável.

Protocolo

1. Preparação da amostra de RMN

1. Expresse e purifique uma amostra de ²H,¹⁵N-labled da proteína de interesse.
   NOTA: Enquanto uma amostra de proteína de ¹⁵N pode ser usada para aquisição do experimento CPMG RD, a perdateração (quando possível) aumenta drasticamente a qualidade dos dados obtidos. Protocolos para a produção de proteínas perdidos estão disponíveis na literatura¹³.
2. Tampão troque a amostra de proteína purificada em um tampão de RMR desgaseado.
3. Transfira a amostra de RMN para o tubo NMR.
   NOTA: A concentração da amostra de RMN precisa ser cuidadosamente otimizada para maximizar a relação sinal-ruído e minimizar a ocorrência de interações proteína-proteína. Em geral, a faixa de concentração típica para experimentos cpmg é de 0,1-1,0 mM.

2. Primeira configuração do experimento NMR

1. Baixe e descompacte os Arquivos Suplementares.
2. Copie os arquivos bits.vv e trosy_15N_cpmg.vv (localizados na pasta denominada pulseprogram) no diretório do programa de pulso (
3. Abra o software de aquisição e copie um experimento^H-15N HSQC anteriormente ^executadoem um novo experimento usando o edcde comando .
4. Usando o pulprog decomando, carregue o programa de pulso trosy_15N_cpmg.vv no experimento recém-criado.
5. Configure o experimento CPMG usando as instruções fornecidas no final do arquivo do programa de pulso (trosy_15N_cpmg.vv).

3. Configuração de rotina do experimento NMR

1. Introduza a amostra no ímã e execute todas as etapas básicas para aquisição de qualquer experimento NMR: bloquear e shim a amostra; combinar e sintonizar os canais ¹H e ¹⁵N.
2. Defina p1 e p7 até a duração dos pulsos ^{de 1}H e ¹⁵N duros de 90°, respectivamente.
   NOTA: Para obter ótimos resultados, é importante calibrar o pulso ^{de 15}N 90° com muito cuidado. A calibração é geralmente realizada usando uma amostra de 100 mM de ¹⁵ureias rotuladas em N em DMSO, conforme descrito no manual do espectrômetro. Além disso, é possível verificar novamente a calibração diretamente na amostra NMR de trabalho adquirindo o primeiro incremento de ^umespectro^H-15N HSQC no qual o pulso ^{de 15}N 90° do primeiro bloco INEPT é alterado para um pulso de 180°. Se a calibração estiver correta, deve ser obtido um nulo.
3. Na janela de aquisição, defina a largura central e espectral para as dimensões ^{de 1}H e ¹⁵N.
   NOTA: Centralizar o espectro ^{de 1}H na frequência do sinal de água para a supressão ideal da água.
4. Defina o atraso de relaxamento (d30) igual a 0,7 T₂, onde T₂ é o tempo de relaxamento transversal esperado de ¹⁵N de sua proteína.
   NOTA: O valor do d30 pode ser otimizado empiricamente para obter os melhores resultados.
5. Use o vclist de comando para criar uma lista de números inteiros correspondentes ao parâmetro n na Figura 1A e Figura 1B. Certifique-se de que cada entrada na lista corresponde a um campo CPMG diferente (ν_cpmg) de acordo com ν_cpmg = 4 x n / d30. Certifique-se de que o primeiro número da lista é 0 (isso corresponde ao experimento de referência para o qual o bloco CPMG é ignorado e d30 = 0 s) e não usar números maiores que 1.000 x d30 / 4. Números maiores do que esse limite_resultam em > de 1 kHz e podem danificar a sonda.
6. Defina l8 para o número de entradas no vclist, l3 para o número de pontos reais para a dimensão indireta (geralmente uma faixa de 64-200 é definida para l3), e 1 td igual a l8 x l3 x 2.
   NOTA: Realize as etapas 3.7-3.11 para otimizar a supressão da água.
7. Definir o ganho do receptor (rg) para 1; abrir o arquivo do programa de pulso (edcpul), ir para a linha 91, remover o ponto e vírgula anterior ao goto 999e salvar o arquivo.
8. Utilizando os gs de comando ajuste os parâmetros spdb0 (ou spdw0) a fim de minimizar a intensidade do sinal FID.
9. Reintroduza o ponto e vírgula na linha 91 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo.
10. Repita as etapas 3.7-3.9 para otimizar o spdb11 (linha 168 do arquivo do programa de pulso), spdb2 (linha 179 do arquivo do programa de pulso) e pldb2 (linha 184 do arquivo do programa de pulso).
11. Execute a rga de comando para otimizar o ganho do receptor.
12. Defina o número de scans(ns) para um múltiplo de 8.
13. Execute o comando zg para iniciar o experimento.

4. Processamento e análise dos dados de RMN

1. Copie a pasta chamada Process (Arquivos Suplementares) no diretório que contém o arquivo ser.
2. Use os arquivos sep_fid.com e ft2D.com para processar os dados NMR.
   NOTA: Instruções sobre como editar os scripts de processamento são fornecidas dentro dos arquivos sep_fid.com e ft2D.com.
3. Abra os arquivos da UCSF contidos no diretório CPMG_Sparky_files em Sparky.
   NOTA: Os arquivos ucsf são criados pelos scripts de processamento. Há um arquivo ucsf para cada entrada no vclist. O primeiro arquivo ucsf (test_1.ucsf) contém o experimento de referência. Os arquivos subsequentes da UCSF (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) são encomendados do menor ao maior valor de_{ν cpmg}.
4. Escolha os picos cruzados NMR no espectro NMR de referência (test_1.ucsf).
5. Selecione todos os picos cruzados escolhidos usando o comando Sparky pa.
6. Executar o comando Sparky rh. Este comando abre uma janela de diálogo. Selecione as alturas deopção na mesma posição em cada espectro . Clique em Configuração e verifique todos os espectros NMR. Clique em Atualizar e salve o arquivo de saída no diretório de trabalho. O arquivo de saída contém a matriz das intensidades de sinal sobre todos os espectros NMR abertos.
   NOTA: Protocolos mais precisos que usam o ajuste de linha para recuperar intensidades de experimentos pseudo-3D intercalados foram descritos na literatura¹⁴. O software disponível gratuitamente para montagem de linha está disponível em https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) e dentro do NMRPipe (módulo nLinLS) e SPARKY (módulo de ti).
7. Para cada campo CPMG, converta as intensidades de sinal para taxas de R₂ utilizando a fórmula, onde I₀ e I_d30 são a intensidade da referência (vc = 0) e relaxada (vc > 0) espectros NMR, respectivamente.
   NOTA: Nos Arquivos Suplementares,é fornecido um modelo do arquivo de planilha (R2_calc.xls) usado para converter as intensidades de sinal em taxas de R₂ e visualizar os perfis RD.
8. Leia o nível de ruído no espectro de referência usando o comando Sparky st e propigue o erro nas taxas R_2.
   NOTA: Nos Arquivos Suplementares,é fornecido um modelo do arquivo de planilha (R2_calc.xls) usado para propagar o erro nas taxas de R₂ medidos.

5. Montagem de curvas RD

1. Copie a pasta nomeada RD_fitting(Arquivos Suplementares)no diretório de trabalho.
2. Para cada pico de RMR atribuído, estimar R_ex calculando as taxas R ₂ medidas nas taxas mais baixas e mais altas do vclist.
3. Inspecione visualmente as curvas RD com R_ex maior que duas vezes o erro estimado e descarte todas as curvas RD que são muito barulhentos para serem modeladas com precisão.
   NOTA: O ruído no_ex R pode ser propagado a partir dos erros ligados e .
4. Prepare um arquivo de entrada para o script de montagem usando todas as curvas RD com_{R ex} maior que duas vezes o erro estimado.
   NOTA: Instruções detalhadas sobre a preparação dos arquivos de entrada são fornecidas dentro dos scripts de montagem. Os arquivos de entrada de exemplo são fornecidos como Arquivos Suplementares. Comumente, os dados RD são medidos em dois campos estáticos diferentes e instalados simultaneamente. Neste protocolo, são necessários dois arquivos de entrada diferentes(Arquivos Suplementares).
5. Encaixe os dados RD usando os scripts fornecidos em Arquivos Suplementares.
   NOTA: Dois scripts diferentes são fornecidos para executar um ajuste global baseado em resíduos ou um ajuste global das curvas RD, respectivamente. Ambos os scripts se encaixam nas curvas RD usando um modelo de troca de dois sites e a equação carver-richards. Instruções mais detalhadas são fornecidas dentro dos scripts de montagem. Pacotes de software adicionais como Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) e CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/ ) estão disponíveis para realizar a montagem de dados usando as equações Block-McConnell.
6. Teste a confiabilidade dos parâmetros instalados estimando o χ² reduzido em função de p_b e k_ex.
   NOTA: O χ² reduzido é fornecido no arquivo de saída. p_b e k_ex podem ser contidos a valores específicos usando limites inferiores e superiores nos procedimentos de montagem. Em nossos scripts, os limites inferiores e superiores para p_b são lb(2) e ub(2), respectivamente. Os limites inferior e superior para k_ex são lb(3) e ub(3), respectivamente.
7. Estime o erro nos parâmetros instalados. Isso pode ser feito definindo o valor de MC_fac no script para 1 e repetindo o encaixe várias vezes (normalmente >20 repetições). O erro em cada parâmetro é estimado como o desvio padrão da distribuição.
   NOTA: A configuração MC_fac para 1 gera um conjunto de dados sintético no qual um erro distribuído gaussiano (calculado com base no erro experimental) é adicionado aos dados experimentais.

Resultados

O protocolo descrito aqui resulta na aquisição de perfis RD para cada pico no espectro ^1H-15N TROSY(Figura 3A). A partir dos perfis de RD adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal ^{de 15}N de cada grupo backbone amide(Figura 3A,3B). Ao traçar o_{R ex} na estrutura 3D da proteína sob investigação, é possível identificar as regiões estruturais submetidas...

Discussão

Este manuscrito descreve o protocolo implementado em laboratório para aquisição e análise de ^{dados de 15}N RD sobre proteínas. Em particular, são abordadas as etapas cruciais para a preparação da amostra de RMN, medição dos dados de RMN e análise dos perfis rd. Abaixo alguns aspectos importantes sobre a aquisição e análise de experimentos de RD são discutidos. No entanto, para uma descrição mais aprofundada do experimento e análise de dados, o estudo cuidadoso da literatura original é altamen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryoprobe	Bruker	5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe	Improve sensitivity
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	756822-1	>99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures
Hand driven centrifuge	United Scientific supply	CENTFG1	Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.
High Field NMR spectrometer	Bruker	Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800	Acquisition of the NMR data
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Modeling of the NMR data
NMR pasteur Pipette	Corning Incorporation	7095D-NMR	Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube
NMR tube	Willmad Precision	535-PP-7	5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube
NMRPipe	Institute of Biosciences and Biotechnology research	https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html	NMR data processing
SPARKY	University of California, San Francisco	https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/	Analysis of the NMR data
Tospin 3.2 (or newer)	Bruker	https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html	Acquisition Software