Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón

Resumen

Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.

Resumen

La última etapa de la megacaropoyesis conduce a extensiones citoplasmáticas de megacariocitos maduros, los llamados proplatlets. Mucho se ha aprendido sobre la formación de proplatlet utilizando megacariocitosdiferenciados in vitro; sin embargo, existe una creciente evidencia de que los sistemas de cultivo convencionales no recapitulan fielmente el proceso de diferenciación/maduración que tiene lugar dentro de la médula ósea. En este manuscrito, presentamos un método de explante descrito inicialmente en 1956 por Thiéry y Bessis para visualizar megacariocitos que han madurado en su entorno nativo, evitando así posibles artefactos y malas interpretaciones. Las médulas óseas frescas se recogen enjuagando los fémures de los ratones, se cortan en secciones transversales de 0,5 mm y se colocan en una cámara de incubación a 37 ° C que contiene un tampón fisiológico. Los megacariocitos se hacen gradualmente visibles en la periferia del explante y se observan hasta 6 horas bajo un microscopio invertido acoplado a una cámara de video. Con el tiempo, los megacariocitos cambian su forma, con algunas células que tienen una forma esférica y otras que desarrollan extensiones gruesas o extienden muchos proplatelets delgados con ramificaciones extensas. Se llevan a cabo investigaciones cualitativas y cuantitativas. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido, ya que numerosos megacariocitos están presentes, y clásicamente la mitad de ellos forman proplalets en 6 horas en comparación con 4 días para los megacariocitos de ratón cultivados. Además del estudio de ratones mutantes, una aplicación interesante de este método es la evaluación directa de los agentes farmacológicos en el proceso de extensión del proplatelet, sin interferir con el proceso de diferenciación que puede ocurrir en los cultivos.

Introducción

La técnica de explante de médula ósea fue desarrollada por primera vez por Thiéry y Bessis en 1956 para describir la formación de extensiones citoplasmáticas de megacariocitos de rata como un evento inicial en la formación de plaquetas¹. Utilizando contraste de fase y técnicas cinematográficas, estos autores caracterizaron la transformación de megacariocitos redondos maduros en células trombocitogénicas "parecidas a calamares" con extensiones citoplasmáticas que muestran movimientos dinámicos de elongación y contracción. Estos brazos se vuelven progresivamente más delgados hasta que se vuelven filiformes con pequeñas hinchazones a lo largo de los brazos y en las puntas. Estas elongaciones típicas de megacariocitos, obtenidas in vitro y en medios líquidos, tienen ciertas similitudes con las plaquetas observadas en la médula ósea fija, donde los megacariocitos sobresalen largas extensiones a través de las paredes sinusoides en la circulación sanguínea^2,3. El descubrimiento y clonación de TPO en 1994, permitió diferenciar megacariocitos en cultivo capaces de formar extensiones proplatletas similares a las descritas en los explantes de médula ósea^4,5,6. Sin embargo, la maduración de los megacariocitos es mucho menos eficiente en condiciones de cultivo, en particular la extensa red de membrana interna de los megacariocitos maduros de la médula ósea está subdesarrollada en los megacariocitos cultivados, lo que dificulta los estudios sobre los mecanismos de la biogénesis plaquetaria^7,8.

Detallamos aquí el modelo de explante de médula ósea, basado en Thiéry y Bessis, para seguir en tiempo real la formación de proplatlet de megacariocitos de ratón, que han madurado completamente en su entorno nativo, eludiendo así posibles artefactos in vitro y malas interpretaciones. Los resultados obtenidos en ratones adultos de tipo salvaje se presentan para ilustrar la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatlets, su morfología y la complejidad de los proplatlets. También introducimos una estrategia de cuantificación rápida para la validación de la calidad para garantizar la precisión y robustez de los datos durante el proceso de registro de megacariocitos. El protocolo aquí presentado es la versión más reciente del método publicado como libro capítulo anteriormente⁹.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas europeas 2010/63/EU y el Comité CREMEAS sobre la Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Preparación de reactivos

1. Preparar reactivos como se describe en la Tabla 1.
   1. Para el Stock I, disuelva cada polvo por separado. Asegúrese de que la osmolaridad de la preparación sea superior a 295 mOsm/L. Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante un año.
   2. Para la preparación del tampón de Tyrode, haga la solución como se describe en la Tabla 1,ajuste el volumen a 100 ml con agua destilada y agregue 0,1 g de sacarosa D (+) anhidra. Ajuste a pH 7.3 usando 1 N HCl según sea necesario y la osmolaridad a 295 mOsm/L. Para prevenir el crecimiento bacteriano, agregue penicilina G a 10 U/ml de concentración final y sulfato de estreptomicina a 0,29 mg/ml de concentración final. Filtrar la solución final a través de poros de 0,22 μm.

2. Preparación de la configuración experimental

1. El día del experimento, caliente el tampón del Tyrode a 37 ° C y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 ° C.
2. Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas de 5 ml, 21 G, fórceps, cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo centrífugo de 15 ml(Figura 1A).

3. Aislamiento de la médula ósea del ratón

1. Eutanasiar ratones C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad por asfixia por CO₂ y luxación cervical. Esto debe ser hecho rápidamente por una persona competente y calificada.
2. Para evitar la contaminación microbiana, remoje el cuerpo del ratón en etanol al 70% (v / v) antes de eliminar los fémures. Utilizar instrumentos desinfectados en etanol al 70% para la disección. Recoge los dos fémures y límpialos eliminando cualquier tejido adherente. Después de una rápida inmersión en etanol, colóquelos en un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de Tyrode.
3. Corte las epífisis con una cuchilla de afeitar afilada y enjuague la médula ósea con una jeringa de 5 ml llena de tampón de Tyrdode de 2 ml. Para lograr esto, introduzca una aguja de 21 G en la abertura del fémur (en el lado de la rodilla) y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto(Figura 1B,C). Mantenga la sesión de recolección de médula lo más breve posible (menos de 10 min).

4. Seccionamiento de la médula ósea y colocación en la cámara de incubación

1. Use una pipeta de plástico de 3 ml para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Es importante que las muestras estén cubiertas con tampón para evitar que se sequen (Figura 1D).
   NOTA: Evite el flujo-reflujo para minimizar las cizallas que podrían disociar el tejido.
2. Debajo de un estereomitroscopio (10x), corte los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado. Luego corte las secciones transversales con una cuchilla de afeitar afilada. Las secciones deben ser lo suficientemente delgadas como para permitir una observación detallada, pero asegúrese de que los megacariocitos no se dañen por compresión (generalmente con un grosor de alrededor de 0,5 mm)(Figura 1E,F).
   NOTA: Las secciones están hechas con una cuchilla de afeitar afilada y debajo de una lupa para ajustar su grosor a aproximadamente 0,5 mm. Solo se seleccionan las secciones de espesor uniforme. Este procedimiento no es complicado pero su estandarización requiere cierta experiencia.
3. Usando una pipeta de plástico, recolecte 10 secciones en un tubo de 1 ml que contenga el tampón de Tyrode(Figura 1G).
4. Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 mm (Figura 1H).
5. Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 μL del tampón de Tyrode complementado con suero de ratón al 5 %.
   NOTA: Es en esta etapa que se pueden agregar agentes farmacológicos para evaluar su impacto en la formación de proplatlet.
6. Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con una cubierta de la dimensión 22 x 55 mm. Incline el la cubierta mientras se pega para evitar la formación de burbujas de aire(Figura 1I).
7. Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 °C. A partir de este momento, se inicia el cronómetro (T= 0 h). El experimento dura 6 h a 37 °C (T = 6 h).

5. Observación en tiempo real de explantes de médula ósea

1. Use un microscopio de contraste de fase invertida (lente 40x para aumento) acoplado a una cámara de video para observar los explantes de médula ósea. Deje que las células se incuben durante 30 minutos antes de comenzar la observación. Mientras se observa, es necesario ajustar el enfoque porque los megacariocitos se están moviendo.
   NOTA: Otros modos de observación son posibles (por ejemplo, DIC, fluorescencia utilizando ratones cuyos megacariocitos expresan un marcador fluorescente endógeno), pero la microscopía de contraste de fase es óptima para visualizar claramente las extensiones de megacariocitos largas y delgadas, lo que permite una cuantificación precisa. Después de 30 min, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante, formando una monocapa. Después de 1 h de incubación, los megacariocitos pueden ser identificados por su gran tamaño y núcleos polilobulados (Figura 1J,K). Después de 3 h de incubación, el número de megacariocitos aumenta y algunos tienen largas extensiones.
2. Realiza vídeos para grabar la transformación de los megacariocitos.

6. Cuantificación de los megacariocitos extensibles de proplatelet

1. Dibuje un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación (Figura 1K).
2. Después de 1 h, identifique los megacariocitos visibles (es decir, células polilobuladas gigantes) en la periferia de cada sección y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de 3 y 6 h.
   NOTA: Sobre la base del dibujo, cada megacariocitos puede ser fácilmente localizado a lo largo del tiempo y la evolución de su morfología analizada (por ejemplo, tamaño, deformación, extensión proplatelet, etc.). Otra posibilidad es el uso de un software de navegación específico.

Resultados

Resultados cualitativos. Al comienzo del experimento, todas las células se compactan en la sección de médula ósea. Las células tardan 30 minutos en hacerse claramente visibles en la periferia de los explantes. Los megacariocitos son entonces reconocibles por su gran tamaño y su evolución puede ser estudiada a lo largo del tiempo (tamaño, forma, dinámica, extensión proplatelet y liberación plaquetaria)(Figura 2A). Los megacariocitos pequeños tienen un diámetro en...

Discusión

Aquí describimos un método in vitro simple y de bajo costo para evaluar la eficiencia de los megacariocitos para extender los proplatlets que han crecido en la médula ósea. El modelo de explante de médula ósea para ratón tiene cuatro ventajas principales. En primer lugar, no se requieren habilidades técnicas avanzadas. En segundo lugar, el tiempo necesario para obtener proplatlets extensibles de megacariocitos es bastante corto, solo 6 horas para el método de explante, en comparación con un mínimo de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270