Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши

Резюме

Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.

Аннотация

Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.

Введение

Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов^1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro и в жидких средах, имеют определенное сходство с тромбоцитами, наблюдаемыми в фиксированном костном мозге, где мегакариоциты выступают длинными расширениями через синусоидальные стенки в кровообращение^2,3. Открытие и клонирование ТПО в 1994 г. позволило дифференцировать мегакариоциты в культуре, способные образовывать расширения проплатлетов, напоминающие описанные в костном мозговых эксплантатах^4,5,6. Однако созревание мегакариоцитов гораздо менее эффективно в условиях культивирования, в частности, обширная внутренняя мембранная сеть зрелых мегакариоцитов костного мозга недоразвита в культивированных мегакариоцитах, что затрудняет исследования механизмов биогенеза тромбоцитов^7,8.

Здесь мы подробно описываем модель экспланта костного мозга, основанную на Тьери и Бессисе, чтобы проследить в реальном времени за образованием проплатлетов мышиных мегакариоцитов, которые полностью созрели в своей родной среде, тем самым обходя возможные артефакты in vitro и неправильные интерпретации. Представлены результаты, полученные у взрослых мышей дикого типа, иллюстрирующие способность мегакариоцитов к расширению проплацетов, их морфологию и сложность проплацелетов. Мы также внедряем стратегию быстрой количественной оценки для проверки качества для обеспечения точности и надежности данных в процессе регистрации мегакариоцитов. Протокол, представленный здесь, является самой последней версией метода, опубликованной в виде главы книги^{ранее 9.}

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Подготовка реагентов

1. Готовят реагенты, как описано в таблице 1.
   1. Для запаса I растворите каждый порошок отдельно. Убедитесь, что осмолярность препарата выше 295 мОсм/л. Этот раствор можно хранить при 4 °C в течение одного года.
   2. Для буферного приготовления тирода внесите раствор, как описано в таблице 1,отрегулируйте объем до 100 мл с дистиллированной водой и добавьте 0,1 г безводной D (+) сахарозы. При необходимости отрегулируйте pH 7,3 с использованием 1 N HCl и осмолярность до 295 мОсм/л. Для предотвращения роста бактерий добавляют пенициллин G в конечной концентрации 10 Ед/мл и сульфат стрептомицина в конечной концентрации 0,29 мг/мл. Процедить конечный раствор через поры 0,22 мкм.

2. Подготовка экспериментального установки

1. В день эксперимента нагрейте буфер Тирода при 37 °C и включите нагревательную камеру микроскопа, чтобы довести температуру до 37 °C.
2. Подготовьте все необходимые инструменты, такие как таймер, инкубационные камеры, шприцы 5 мл, 21 г, щипцы, лезвие бритвы, пипетки Пастера, стеклянные слайды и 15 мл центрифужная трубка(рисунок 1А).

3. Выделение костного мозга мыши

1. Усыпленить мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель путем удушья_CO2 и вывиха шейки матки. Это должно быть сделано быстро компетентным и квалифицированным человеком.
2. Чтобы избежать микробного загрязнения, замочите тело мыши в 70% (v/v) этаноле перед удалением бедренных кочных кочных кочных масс. Используйте инструменты, продезинфицированные в 70% этаноле для рассечения. Соберите две бедренные кости и очистите их, удалив любую адгезивную ткань. После быстрого погружения в этанол поместите их в 15 мл центрифужную трубку, содержащую 2 мл буфера Tyrode.
3. Отрежьте эпифизы острым лезвием бритвы и промывайте костный мозг с помощью шприца 5 мл, заполненного буфером Tyrdode 2 мл. Чтобы достичь этого, введите иглу 21 G в отверстие бедренной кости (со стороны колена) и медленно нажмите на поршень, чтобы извлечь неповрежденный цилиндр костного мозга(рисунок 1B,C). Держите сеанс сбора костного мозга как можно короче (менее 10 минут).

4. Сечение костного мозга и помещение в инкубационную камеру

1. Используйте пластиковую пипетку объемом 3 мл, чтобы аккуратно и аккуратно перенести неповрежденный костный мозг на стеклянную горку. Важно, чтобы образцы были покрыты буфером для предотвращения высыхания(рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте потока-опрокидываемого потока, чтобы свести к минимуму сдвиги, которые могут диссоциировать ткань.
2. Под стереомикроскопом (10x) отрежьте концы костного мозга, которые могли быть сжаты во время промывки. Затем вырежьте поперечные участки острым лезвием бритвы. Срезы должны быть достаточно тонкими, чтобы можно было провести подробное наблюдение, но гарантировать, что мегакариоциты не повреждаются при сжатии (обычно толщина около 0,5 мм)(рисунок 1E,F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Секции выполнены с острым лезвием бритвы и под лупой для регулировки их толщины примерно до 0,5 мм. Выбираются только участки равномерной толщины. Эта процедура не сложна, но ее стандартизация требует некоторого опыта.
3. Используя пластиковую пипетку, соберите 10 секций в трубку объемом 1 мл, содержащую буфер Тирода(рисунок 1G).
4. Аккуратно перенесите секции в инкубационную камеру диаметром 13 мм(рисунок 1Н).
5. Аспирируйте буфер и отрегулируйте объем до 30 мкл буфера Tyrode, дополненного 5% сывороткой мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Именно на этом этапе могут быть добавлены фармакологические средства для оценки их влияния на образование проплателетов.
6. Расположите секции на расстоянии. Запечатайте самоклеящуюся камеру с помощью крышки размером 22 х 55 мм. Наклоняйте крышку во время прилипания, чтобы избежать образования пузырьков воздуха(рисунок 1I).
7. Поместите камеру в нагревательную камеру при 37 °C. С этого момента запускается хронометр (T= 0 ч). Эксперимент длится 6 ч при 37 °C (T= 6 ч).

5. Наблюдение в режиме реального времени за эксплантами костного мозга

1. Используйте инвертированный фазоконтрастный микроскоп (40-кратный объектив для увеличения), соединенный с видеокамерой, для наблюдения за эксплантами костного мозга. Дайте клеткам инкубироваться в течение 30 минут перед началом наблюдения. Во время наблюдения необходимо корректировать фокус, потому что мегакариоциты движутся.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возможны и другие режимы наблюдения (например, ДВС-травма, флуоресценция с использованием мышей, чьи мегакариоциты экспрессируют эндогенный флуоресцентный маркер), но фазово-контрастная микроскопия оптимальна для четкой визуализации длинных и тонких расширений мегакариоцитов, что позволяет точно количественно оценить. Через 30 мин клетки костного мозга постепенно мигрируют на периферию экспланта, образуя монослой. После 1 ч инкубации мегакариоциты можно идентифицировать по их большим размерам и полилобуляционным ядрам(рисунок 1J,K). После 3 ч инкубации количество мегакариоцитов увеличивается, а некоторые имеют длительные расширения.
2. Делайте видео для записи трансформации мегакариоцитов.

6. Количественная оценка проплателет-расширяющих мегакариоцитов

1. Нарисуйте карту для локализации каждого участка в инкубационной камере(рисунок 1K).
2. Через 1 ч определите видимые мегакариоциты (т.е. гигантские полилобулированные клетки) на периферии каждого участка и нарисуйте их положения на рисунке. Повторите эту процедуру через 3 и 6 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На основании рисунка каждый мегакариоцит может быть легко локализован с течением времени и проанализирована эволюция их морфологии (например, размер, деформация, расширение проплатлетов и т.д.). Другой возможностью является использование специального навигационного программного обеспечения.

Результаты

Качественные результаты. В начале эксперимента все клетки уплотняются в области костного мозга. Требуется 30 минут, чтобы клетки стали хорошо видны на периферии эксплантов. Затем мегакариоциты распознаются по их большому размеру, и их эволюция затем может быть изучена с течени...

Обсуждение

Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270