Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca

Resumo

Aqui, detalhamos o método de explanta da medula óssea, desde a preparação da amostra até a análise de slides microscópicas, para avaliar a capacidade de megacaiócitos que se diferenciaram em seu ambiente fisiológico para formar proplatelets.

Resumo

A última etapa da megacaripoiese leva a extensões citoplasmáticas de megacaiócitos maduros, os chamados proplatelets. Muito se tem aprendido sobre a formação proplatelet usando megacariócitos in vitro-diferenciados; no entanto, há uma evidência crescente de que os sistemas de cultura convencionais não recapitulem fielmente o processo de diferenciação/maturação que ocorre dentro da medula óssea. Neste manuscrito, apresentamos um método de explanta inicialmente descrito em 1956 por Thiéry e Bessis para visualizar megacaiócitos que amadureceram em seu ambiente nativo, contornando assim artefatos potenciais e interpretações erradas. As medulas ósseas frescas são coletadas lavando os fêmures de camundongos, fatiadas em seções transversais de 0,5 mm e colocadas em uma câmara de incubação a 37 °C contendo um tampão fisiológico. Megacariócitos tornam-se gradualmente visíveis na periferia explant e são observados até 6 horas sob um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo. Com o tempo, os megacaiócitos mudam de forma, com algumas células tendo uma forma esférica e outras desenvolvendo extensões grossas ou estendendo muitas proplatelets finas com ramificações extensas. Tanto investigações qualitativas quanto quantitativas são realizadas. Este método tem a vantagem de ser simples, reproduzível e rápido, pois numerosos megacaiócitos estão presentes, e classicamente metade deles forma proplatelets em 6 horas em comparação com 4 dias para megacariócitos de camundongos cultivados. Além do estudo de camundongos mutantes, uma aplicação interessante desse método é a avaliação direta dos agentes farmacológicos no processo de extensão proplatelet, sem interferir no processo de diferenciação que pode ocorrer nas culturas.

Introdução

A técnica de explant de medula óssea foi desenvolvida pela primeira vez por Thiéry e Bessis em 1956 para descrever a formação de extensões citoplasmáticas de megacariote de ratos como um evento inicial na formação de plaquetas¹. Utilizando o contraste de fase e técnicas cinematográficas, esses autores caracterizaram a transformação de megacaiócitos redondos maduros em células trombocitopegênicas "semelhantes a lulas" com extensões citoplasmáticas mostrando movimentos dinâmicos de alongamento e contração. Estes braços ficam progressivamente mais finos até ficarem filiformes com pequenos inchaços ao longo dos braços e nas pontas. Estes alongamentos típicos de megacaiócitos, obtidos in vitro e em mídia líquida, têm certas semelhanças com plaquetas observadas em medula óssea fixa, onde megacariócitos se projetam extensões longas através das paredes sinusoides na circulação sanguínea^2,3. A descoberta e clonagem de TPO em 1994 permitiu diferenciar megacariócitos na cultura capaz de formar extensões proplateletas semelhantes às descritas nas explantas de medula óssea^4,5,6. No entanto, o amadurecimento do megacaito é muito menos eficiente em condições culturais, notadamente a extensa rede interna de membrana de megacariócitos amadurecidos de medula óssea é subdesenvolvida em megacaiócitos cultivados, dificultando estudos sobre os mecanismos da biogênese plaqueta^7,8.

Detalhamos aqui o modelo de explante de medula óssea, baseado em Thiéry e Bessis, para seguir em formação proplatelet em tempo real de megacariócitos de camundongos, que amadureceram totalmente em seu ambiente nativo, contornando assim possíveis artefatos in vitro e interpretações erradas. Os resultados obtidos em camundongos adultos do tipo selvagem são apresentados para ilustrar a capacidade do megacariote de estender proplatelets, sua morfologia e a complexidade dos proplatelets. Também introduzimos uma estratégia de quantificação rápida para validação da qualidade para garantir a precisão e robustez dos dados durante o processo de gravação de megacariote. O protocolo aqui apresentado é a versão mais recente do método publicado como um capítulo de livro anteriormente⁹.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética dos Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Preparação de reagentes

1. Prepare os reagentes conforme descrito na Tabela 1.
   1. Para o Estoque I, dissolva cada pó separadamente. Certifique-se de que a osmolaridade da preparação é superior a 295 mOsm/L. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C durante um ano.
   2. Para a preparação do tampão da Tyrode, faça a solução conforme descrito na Tabela 1,ajuste o volume para 100 mL com água destilada e adicione 0,1 g de sacarose anidro D (+). Ajuste ao pH 7.3 usando 1 N HCl conforme necessário e o osmolaridade a 295 mOsm/L. Para evitar o crescimento bacteriano, adicione a penicilina G a 10 U/mL de concentração final e sulfato de estreptomicina a 0,29 mg/mL de concentração final. Filtre a solução final através de poros de 0,22 μm.

2. Preparação da configuração experimental

1. No dia do experimento, aqueça o tampão do Tyrode a 37 °C, e ligue a câmara de aquecimento do microscópio para elevar a temperatura a 37 °C.
2. Prepare todas as ferramentas necessárias, como um temporizador, câmaras de incubação, seringas de 5 mL, 21 G, fórceps, lâmina de barbear, pipetas Pasteur, lâminas de vidro e tubo de centrífugas de 15 mL(Figura 1A).

3. Isolamento da medula óssea do rato

1. Euthanize C57BL/6 camundongos de 8 a 12 semanas por asfixia de CO₂ e luxação cervical. Isso deve ser feito rapidamente por uma pessoa competente e qualificada.
2. Para evitar contaminação microbiana, mergulhe o corpo do rato em 70% (v/v) etanol antes de remover os fêmures. Use instrumentos desinfetados em 70% de etanol para a dissecção. Colete os dois fêmures e limpe-os removendo qualquer tecido aderente. Após rápida imersão no etanol, coloque-os em tubo centrífugo de 15 mL contendo tampão tyrode de 2 mL.
3. Corte as epífitas usando uma lâmina afiada e lave a medula óssea usando uma seringa de 5 mL preenchida com tampão de Tyrdode de 2 mL. Para isso, introduza uma agulha de 21 G na abertura do fêmur (no lado do joelho) e pressione lentamente o êmbolo para recuperar um cilindro de medula intacto(Figura 1B,C). Mantenha a sessão de coleta de medula o mais breve possível (menos de 10 min).

4. Secção e colocação de medula óssea na câmara de incubação

1. Use uma pipeta de plástico de 3 mL para transferir cuidadosamente e suavemente a medula óssea intacta para uma lâmina de vidro. É importante que as amostras estejam cobertas com tampão para evitar a secagem(Figura 1D).
   NOTA: Evite o fluxo de fluxo para minimizar tesouras que possam dissociar o tecido.
2. Sob um estereómico (10x), corte as extremidades da medula que podem ter sido compactadas no momento da descarga. Em seguida, corte as seções transversais com uma lâmina afiada. As seções devem ser finas o suficiente para permitir uma observação detalhada, mas garantir que os megacaiócitos não sejam danificados pela compressão (geralmente espessura em torno de 0,5 mm) (Figura 1E, F).
   NOTA: As seções são feitas com uma lâmina afiada e sob uma lupa para ajustar sua espessura para cerca de 0,5 mm. Apenas as seções de espessura uniforme são selecionadas. Este procedimento não é complicado, mas sua padronização requer alguma experiência.
3. Usando uma pipeta plástica, colete 10 seções em tubo de 1 mL contendo tampão de Tyrode(Figura 1G).
4. Transfira cuidadosamente as seções para uma câmara de incubação com diâmetro de 13 mm(Figura 1H).
5. Aspire o buffer e ajuste o volume para 30 μL do buffer da Tyrode complementado com 5 % de soro do mouse.
   NOTA: É nesta fase que os agentes farmacológicos podem ser adicionados para avaliar seu impacto na formação de proplatelet.
6. Posicione as seções à distância. Sele a câmara autoadesiva com uma mancha de cobertura da dimensão 22 x 55 mm. Incline o deslizamento de tampas enquanto gruda para evitar a formação de bolhas de ar(Figura 1I).
7. Coloque a câmara na câmara de aquecimento a 37 °C. A partir deste momento, o cronômetro é iniciado (T= 0 h). O experimento funciona por 6 h a 37 °C (T= 6 h).

5. Observação em tempo real de explants de medula

1. Use um microscópio de contraste de fase invertida (lente 40x para ampliação) acoplado a uma câmera de vídeo para observar as explantas da medula óssea. Deixe as células incubarem por 30 minutos antes de iniciar a observação. Durante a observação, é necessário ajustar o foco porque os megacaiócitos estão se movendo.
   NOTA: Outros modos de observação são possíveis (por exemplo, DIC, fluorescência usando camundongos cujos megacariócitos expressam um marcador fluorescente endógeno), mas a microscopia de contraste de fase é ideal para visualizar claramente as extensões de megacaiócte longos e finos, permitindo quantificação precisa. Após 30 min, as células de medula migram gradualmente para a periferia da explanta, formando uma monocamada. Após 1h de incubação, megacariócitos podem ser identificados pelo seu grande tamanho e núcleos polilobulados(Figura 1J,K). Após 3h de incubação, o número de megacaiócitos aumenta e alguns têm extensões longas.
2. Faça vídeos para gravar a transformação dos megacariócitos.

6. Quantificação dos megacaitos que estendem a propolato

1. Desenhe um mapa para visualizar cada seção na câmara de incubação(Figura 1K).
2. Após 1h, identifique os megacariócitos visíveis (ou seja, células polilobuladas gigantes) na periferia de cada seção e plote suas posições no desenho. Repita este procedimento depois das 3 e 6 horas.
   NOTA: Com base no desenho, cada megacaiócito pode ser facilmente localizado ao longo do tempo e a evolução de sua morfologia analisada (por exemplo, tamanho, deformação, extensão proplatelet, etc.). Outra possibilidade é o uso de um software de navegação específico.

Resultados

Resultados qualitativos. No início do experimento, todas as células são compactadas na seção de medula óssea. Leva 30 minutos para as células se tornarem claramente visíveis na periferia das explantas. Os megacaiócitos são então reconhecíveis pelo seu grande tamanho e sua evolução pode então ser estudada ao longo do tempo (tamanho, forma, extensão dinâmica, extensão de proplato e liberação de plaquetas)(Figura 2A). Pequenos megacaiócitos têm um diâmetr...

Discussão

Aqui descrevemos um método in vitro simples e de baixo custo para avaliar a eficiência dos megacaiócitos para estender proplatelets que cresceram na medula óssea. O modelo de explant de medula óssea para mouse tem quatro principais vantagens. Primeiro, não são necessárias habilidades técnicas avançadas. Em segundo lugar, o tempo necessário para obter proplatelets de prolatos de extensão de megacaito é bastante curto, apenas 6 horas para o método de explant, em comparação com um mínimo de 4 dias ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270