Proplatbildungsdynamik von mausfrischen Knochenmark-Explantaten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Knochenmark-Explantationsmethode, von der Probenvorbereitung bis zur mikroskopischen Objektträgeranalyse, um die Fähigkeit von Megakaryozyten, die sich in ihrer physiologischen Umgebung differenziert haben, zu bewerten, Proplatelette zu bilden.

Zusammenfassung

Das letzte Stadium der Megakaryopoese führt zu zytoplasmatischen Erweiterungen aus reifen Megakaryozyten, den sogenannten Proplaten. Es wurde viel über die Proplatbildung unter Verwendung von in vitro-differenziertenMegakaryozyten gelernt; Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass herkömmliche Kultursysteme den Differenzierungs- / Reifungsprozess, der im Knochenmark stattfindet, nicht getreu rekapitulieren. In diesem Manuskript stellen wir eine explantierte Methode vor, die ursprünglich 1956 von Thiéry und Bessis beschrieben wurde, um Megakaryozyten zu visualisieren, die in ihrer natürlichen Umgebung gereift sind, wodurch potenzielle Artefakte und Fehlinterpretationen umgangen werden. Frische Knochenmarke werden durch Spülen der Oberschenkelknochen von Mäusen gesammelt, in 0,5 mm Querschnitte geschnitten und in eine Inkubationskammer bei 37 °C gegeben, die einen physiologischen Puffer enthält. Megakaryozyten werden allmählich an der explantaten Peripherie sichtbar und werden bis zu 6 Stunden unter einem inversen Mikroskop in Verbindung mit einer Videokamera beobachtet. Im Laufe der Zeit ändern Megakaryozyten ihre Form, wobei einige Zellen eine kugelförmige Form haben und andere dicke Erweiterungen entwickeln oder viele dünne Proplateletten mit ausgedehnter Verzweigung verlängern. Es werden sowohl qualitative als auch quantitative Untersuchungen durchgeführt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, reproduzierbar und schnell ist, da zahlreiche Megakaryozyten vorhanden sind, und klassischerweise bildet die Hälfte von ihnen Proplatelette in 6 Stunden im Vergleich zu 4 Tagen für kultivierte Maus-Megakaryozyten. Neben der Untersuchung von mutierten Mäusen ist eine interessante Anwendung dieser Methode die einfache Bewertung der pharmakologischen Wirkstoffe auf dem Proplatlet-Erweiterungsprozess, ohne den Differenzierungsprozess, der in Kulturen auftreten kann, zu stören.

Einleitung

Die Knochenmark-Explantationstechnik wurde erstmals 1956 von Thiéry und Bessis entwickelt, um die Bildung von zytoplasmatischen Erweiterungen von Megakaryozyten bei Ratten als erstes Ereignis bei der Thrombozytenbildung zu beschreiben¹. Mit Hilfe von Phasenkontrast und kinematografischen Techniken charakterisierten diese Autoren die Umwandlung reifer runder Megakaryozyten in "tintenfischartige" thrombozytogene Zellen mit zytoplasmatischen Erweiterungen, die dynamische Bewegungen der Dehnung und Kontraktion zeigen. Diese Arme werden zunehmend dünner, bis sie mit kleinen Schwellungen entlang der Arme und an den Spitzen filiform werden. Diese typischen Megakaryozytendehnungen, die in vitro und in flüssigen Medien erhalten werden, weisen bestimmte Ähnlichkeiten mit Blutplättchen auf, die im festsitzenden Knochenmark beobachtet wurden, wo Megakaryozyten lange Ausdehnungen durch die Sinuswände in den Blutkreislauf ragen^2,3. Die Entdeckung und Klonierung von TPO im Jahr 1994 ermöglichte es, Megakaryozyten in Kultur zu differenzieren, die in der Lage sind, Proplatleterweiterungen zu bilden, die denen ähneln, die in den Knochenmark-Explantaten^4,5,6beschrieben sind. Die Megakaryozytenreifung ist jedoch unter Kulturbedingungen weit weniger effizient, insbesondere das ausgedehnte interne Membrannetzwerk von knochenmarkgereiften Megakaryozyten ist in kultivierten Megakaryozyten unterentwickelt, was Studien über die Mechanismen der Thrombozytenbiogenese behindert^7,8.

Wir beschreiben hier das Knochenmark-Explantatmodell, das auf Thiéry und Bessis basiert, um in Echtzeit die Proplatletbildung von Maus-Megakaryozyten zu verfolgen, die in ihrer nativen Umgebung vollständig gereift sind und so mögliche In-vitro-Artefakte und Fehlinterpretationen umgehen. Ergebnisse, die an erwachsenen Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden, werden vorgestellt, um die Fähigkeit von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, ihre Morphologie und die Komplexität von Proplaten zu veranschaulichen. Wir führen auch eine schnelle Quantifizierungsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um die Genauigkeit und Robustheit der Daten während des Megakaryozyten-Aufzeichnungsprozesses sicherzustellen. Das hier vorgestellte Protokoll ist die neueste Version der Methode, die als Buch kapitel zuvor⁹veröffentlicht wurde.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg) durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben vorbereiten.
   1. Für die Brühe I jedes Pulver separat auflösen. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität der Zubereitung höher als 295 mOsm/L ist. Diese Lösung kann bei 4 °C für ein Jahr gelagert werden.
   2. Für die Tyrode-Puffervorbereitung die Lösung wie in Tabelle 1beschrieben herstellen, das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml einstellen und 0,1 g wasserfreie D (+)-Saccharose zugeben. Stellen Sie bei Bedarf mit 1 N HCl auf pH 7,3 und die Osmolarität auf 295 mOsm/L ein. Um das Bakterienwachstum zu verhindern, fügen Sie Penicillin G in 10 U / ml Endkonzentration und Streptomycinsulfat in 0,29 mg / ml Endkonzentration hinzu. Die endgültige Lösung wird durch Poren von 0,22 μm filtriert.

2. Vorbereitung des Versuchsaufbaus

1. Erwärmen Sie am Tag des Experiments den Tyrode-Puffer auf 37 ° C und schalten Sie die Heizkammer des Mikroskops ein, um die Temperatur auf 37 ° C zu bringen.
2. Bereiten Sie alle notwendigen Werkzeuge vor, wie z. B. einen Timer, Inkubationskammern, 5-ml-Spritzen, 21 G, eine Pinzette, eine Rasierklinge, Pasteurpipetten, Glasobjektträger und ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1A).

3. Isolierung des Knochenmarks der Maus

1. Euthanasie C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen durch CO 2-Erstickung und zervikale Luxation. Dies sollte schnell von einer kompetenten und qualifizierten Person erledigt werden.
2. Um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden, tränken Sie den Mauskörper in 70% (v / v) Ethanol, bevor Sie die Femuren entfernen. Verwenden Sie instrumente, die in 70% Ethanol desinfiziert sind, für die Dissektion. Sammeln Sie die beiden Femuren und reinigen Sie sie, indem Sie anhaftendes Gewebe entfernen. Nach schnellem Eintauchen in Ethanol werden sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 ml Tyrode-Puffer gegeben.
3. Schneiden Sie die Epiphysen mit einer scharfen Rasierklinge weg und spülen Sie das Knochenmark mit einer 5 ml Spritze, die mit 2 ml Tyrode-Puffer gefüllt ist. Um dies zu erreichen, führen Sie eine 21 G Nadel in die Öffnung des Femurs (auf der Knieseite) ein und drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen intakten Markzylinder zu entnehmen (Abbildung 1B,C). Halten Sie die Knochenmarkentnahme so kurz wie möglich (unter 10 Min.).

4. Schneiden des Knochenmarks und Einsetzen in die Inkubationskammer

1. Verwenden Sie eine 3 ml Kunststoffpipette, um das intakte Knochenmark vorsichtig und vorsichtig auf einen Glasobjektträger zu übertragen. Es ist wichtig, dass die Proben mit Puffer bedeckt sind, um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Vermeiden Sie Flow-Reflow, um Scheren zu minimieren, die das Gewebe dissoziieren könnten.
2. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop (10x) die Enden des Knochenmarks ab, die zum Zeitpunkt der Spülung möglicherweise komprimiert wurden. Dann schneiden Sie Querabschnitte mit einer scharfen Rasierklinge. Abschnitte sollten dünn genug sein, um eine detaillierte Beobachtung zu ermöglichen, aber sicherstellen, dass Megakaryozyten nicht durch Kompression beschädigt werden (normalerweise Dicke um 0,5 mm)(Abbildung 1E,F).
   HINWEIS: Die Abschnitte werden mit einer scharfen Rasierklinge und unter einer Lupe hergestellt, um ihre Dicke auf etwa 0,5 mm einzustellen. Es werden nur die Abschnitte mit gleichmäßiger Dicke ausgewählt. Dieses Verfahren ist nicht kompliziert, aber seine Standardisierung erfordert einige Erfahrung.
3. Sammeln Sie mit einer Kunststoffpipette 10 Abschnitte in einem 1-ml-Röhrchen, das Tyrodes Puffer enthält (Abbildung 1G).
4. Vorsichtig werden die Abschnitte in eine Inkubationskammer mit einem Durchmesser von 13 mm überführt (Abbildung 1H).
5. Aspirieren Sie den Puffer und stellen Sie das Volumen auf 30 μL des Tyrode-Puffers ein, der mit 5 % Mausserum ergänzt wird.
   HINWEIS: In diesem Stadium können pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden, um ihren Einfluss auf die Proplatletbildung zu bewerten.
6. Positionieren Sie die Abschnitte im Abstand. Versiegeln Sie die Selbstklebekammer mit einem Deckglas im Format 22 x 55 mm. Neigen Sie den Deckstab beim Kleben an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden (Abbildung 1I).
7. Stellen Sie die Kammer bei 37 °C in die Heizkammer. Ab diesem Moment wird der Chronometer gestartet (T= 0 h). Das Experiment läuft 6 h bei 37 °C (T= 6 h).

5. Echtzeitbeobachtung von Knochenmark-Explantaten

1. Verwenden Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop (40-fache Linse zur Vergrößerung), das mit einer Videokamera gekoppelt ist, um die Knochenmark-Explantate zu beobachten. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang inkubieren, bevor Sie mit der Beobachtung beginnen. Während der Beobachtung ist es notwendig, den Fokus anzupassen, da sich Megakaryozyten bewegen.
   HINWEIS: Andere Beobachtungsmodi sind möglich (z. B. DIC, Fluoreszenz mit Mäusen, deren Megakaryozyten einen endogenen fluoreszierenden Marker exprimieren), aber die Phasenkontrastmikroskopie ist optimal, um die langen und dünnen Megakaryozytenerweiterungen klar sichtbar zu machen, was eine präzise Quantifizierung ermöglicht. Nach 30 min wandern die Markzellen allmählich an die Peripherie der Explant und bilden eine Monoschicht. Nach 1 h Inkubation können Megakaryozyten durch ihre große Größe und polylobulierte Kerne identifiziert werden (Abbildung 1J, K). Nach 3 h Inkubation nimmt die Anzahl der Megakaryozyten zu und einige haben lange Verlängerungen.
2. Machen Sie Videos, um die Transformation der Megakaryozyten aufzuzeichnen.

6. Quantifizierung der Proplatlet-verlängernden Megakaryozyten

1. Zeichnen Sie eine Karte, um jeden Abschnitt in der Inkubationskammer zu lokalisieren (Abbildung 1K).
2. Identifizieren Sie nach 1 h die sichtbaren Megakaryozyten (dh riesige polylobulierte Zellen) an der Peripherie jedes Abschnitts und zeichnen Sie ihre Positionen auf der Zeichnung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach 3 und 6 Stunden.
   HINWEIS: Auf der Grundlage der Zeichnung kann jeder Megakaryozyt im Laufe der Zeit leicht lokalisiert und die Entwicklung seiner Morphologie analysiert werden (z. B. Größe, Verformung, Proplatenerweiterung usw.). Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung einer speziellen Navigationssoftware.

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Ergebnisse

Qualitative Ergebnisse. Zu Beginn des Experiments werden alle Zellen im Knochenmarkabschnitt verdichtet. Es dauert 30 Minuten, bis die Zellen an der Peripherie der Explantate deutlich sichtbar werden. Die Megakaryozyten sind dann an ihrer Größe erkennbar und ihre Entwicklung kann dann im Laufe der Zeit untersucht werden (Größe, Form, Dynamik, Proplatletverlängerung und Thrombozytenfreisetzung) (Abbildung 2A). Kleine Megakaryozyten haben einen Durchmesser zwischen 20 und...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige In-vitro-Methode zur Bewertung der Effizienz von Megakaryozyten zur Erweiterung von Proplaten, die im Knochenmark gewachsen sind. Das Knochenmark-Explantat-Modell für Die Maus hat vier Hauptvorteile. Erstens sind keine fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten erforderlich. Zweitens ist die Zeit, die benötigt wird, um Megakaryozyten-verlängernde Proplatelets zu erhalten, ziemlich kurz, nur 6 Stunden für die Explantat-Methode, verglichen mit einem Minimu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270