마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학

요약

여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.

초록

메가카요포이시스의 마지막 단계는 성숙한 거대 카르요세포, 소위 프로플라츠에서 세포질 확장으로 이어집니다. 체외에서 -분화 된 메가 카요세포를 사용하여 프로 플라츠판 형성에대해 많은 것을 배웠습니다. 그러나, 기존의 문화 시스템이 골수 내부의 장소를 취하는 분화 / 성숙 과정을 충실하게 재구성하지 않는다는 증거가 증가하고 있다. 이 원고에서는 1956년 티에리와 베시스가 원래 설명한 절묘한 방법을 제시하여 자신의 토착 환경에서 성숙한 거대 카르요세포들을 시각화하여 잠재적인 유물과 오해를 우회합니다. 신선한 골새끼는 마우스의 대퇴골을 플러시하여 수집되고, 0.5mm 단면으로 슬라이스하고, 생리적 완충액을 함유하는 37°C의 인큐베이션 챔버에 배치된다. 메가카요세포는 축출 주변에서 점진적으로 볼 수 있게 되고 비디오 카메라에 결합된 반전된 현미경으로 최대 6시간까지 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라, 메가 카요 세포는 구형 형태를 가지고 다른 두꺼운 확장을 개발하거나 광범위한 분기와 많은 얇은 proplatelet을 확장, 모양을 변경합니다. 정성적 및 정량적 조사가 모두 수행됩니다. 이 방법은 수많은 거대 카르요세포가 존재하므로 간단하고 재현 가능하며 빠르며, 그 중 절반은 배양 마우스 메가카요세포에 대한 4일에 비해 6시간 만에 프로플라틀렛을 형성한다는 장점이 있다. 돌연변이 마우스의 연구 외에도, 이 방법의 흥미로운 적용은 배양에서 발생할 수 있는 분화 과정을 방해하지 않고, 프로플라틀 확장 과정에 대한 약리학제제의 간단한 평가이다.

서문

골수 각질 기술은 1956년 티에리와 베시스에 의해 처음 개발되어 혈소판 형성^1의초기 이벤트로서 쥐 메가카요세포 세포질 확장의 형성을 기술하였다. 위상 대비 및 촬영 기술을 사용하여, 이 저자는 신장과 수축의 동적 움직임을 보여주는 세포질 확장과 "오징어 같은"혈전 세포로 성숙한 둥근 메가 카요세포의 변환을 특징으로. 이 팔은 팔을 따라 그리고 끝에서 작은 붓기와 filiform될 때까지 점진적으로 얇아집니다. 시험관 및 액체 매체에서 얻어진 이러한 전형적인 메가카요세포 신장은 고정형 골수에서 관찰된 혈소판과 일정한 유사성을 가지며, 여기서 거대 카르요퀴트는 혈중 벽으로 시누치성 벽을 통해 긴 연장을 돌출하여 혈액 순환^2,3로돌출된다. 1994년 TPO의 발견 및 복제는 골수 에 기재된 것과 유사한 프로플라틀 확장을 형성할 수 있는 배양에서 메가카르요사이클을 구별할 수 있게^4,5,6. 그러나, 메가카요세포 성숙은 배양 조건에서 훨씬 덜 효율적이며, 특히 골수 성숙 메가카요세포의 광범위한 내부 멤브레인 네트워크는 배양 된 메가 카요사이클로 저개발되어 혈소판 생물 발생^7,8의메커니즘에 대한 연구를 방해한다.

우리는 여기에 Thiéry와 Bessis에 따라 골수 박멸 모델을 자세히 설명, 마우스 메가 카요 사이클의 실시간 proplatelet 형성에 따라, 이는 완전히 자신의 네이티브 환경에서 성숙한, 따라서 체외 유물과 오해에서 가능한 우회. 야생 형 성인 마우스에서 얻은 결과는 프로 플라틀릿, 그들의 형태 및 프로 플라츠의 복잡성을 확장하는 메가 카요사이클의 능력을 설명하기 위해 제시된다. 또한 메가카요세포 기록 과정에서 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 정량화 전략을 도입했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이전에 책 장^9로출판된 방법의 최신 버전입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다.

1. 시약 준비

1. 표 1에설명된 대로 시약을 준비한다.
   1. 스톡 I의 경우 각 분말을 별도로 녹입니다. 준비의 진동이 295 mOsm / L보다 높은지 확인하십시오. 이 용액은 1 년 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
   2. Tyrode의 버퍼 준비를 위해 표 1에설명된 대로 솔루션을 만들고 증류수로 100mL로 볼륨을 조정하고 0.1g 의 무수D(+) 자당을 추가합니다. 필요에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 7.3에 적응하고 295 mOsm / L로 진동합니다. 세균성 성장을 방지하기 위해, 페니실린 G를 추가 10 U/mL 최종 농도 및 연쇄절제술 황산염 0.29 mg/mL 최종 농도. 0.22 μm 모공을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.

2. 실험 설정 준비

1. 실험 당일, 37°C에서 티로드의 완충액을 따뜻하게 하고 현미경의 가열 챔버를 켜서 온도를 37°C로 끌어올립니다.
2. 타이머, 인큐베이션 챔버, 5mL 주사기, 21G, 집게, 면도날, 파스퇴르 파이펫, 유리 슬라이드 및 15mL 원심분리관(그림1A)과같은 필요한 모든 도구를 준비합니다.

3. 마우스 골수의 격리

1. CO₂ 질식 및 자궁 경부 탈구에 의해 8-12 주 세 C57BL/6 마우스를 안락사. 이것은 유능하고 자격을 갖춘 사람에 의해 신속하게 수행해야합니다.
2. 미생물 오염을 방지하기 위해 대퇴골을 제거하기 전에 마우스 몸을 70 % (v /v) 에탄올에 담가 둡니다. 해부에 대해 70% 에탄올에 감염된 기기를 사용하십시오. 두 대퇴골을 수집하고 부착 조직을 제거하여 청소하십시오. 에탄올에 빠르게 침지한 후, 2mL 티로드의 버퍼를 포함하는 15mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.
3. 날카로운 면도날을 사용하여 표피를 자르고 2mL Tyrdode의 버퍼로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 플러시합니다. 이를 위해 21G 바늘을 대퇴골(무릎 쪽)의 개구부로 도입하고 플런저를 천천히 눌러 그대로 골수 실린더(도1B,C)를회수한다. 골수 수집 세션을 가능한 한 짧게 유지하십시오(10분 미만).

4. 골수 단면 및 인큐베이션 챔버에 배치

1. 3mL 플라스틱 파이펫을 사용하여 그대로 있는 골수를 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮기십시오. 샘플이 건조를 방지하기 위해 버퍼로 덮여있는 것이 중요합니다(그림 1D).
   참고: 조직을 해리시킬 수 있는 가위를 최소화하기 위해 흐름 리플로우를 피하십시오.
2. 스테레오 현미경 (10x)에서, 플러시 시 압축 되었을 수 있습니다 골수의 끝을 잘라. 그런 다음 날카로운 면도날로 트랜스버라클 섹션을 잘라냅니다. 섹션은 상세한 관찰을 허용하지만 메가 카요 세포가 압축 (일반적으로 0.5mm 주위 두께)에 의해 손상되지 않도록 충분히 얇아야한다(그림 1E,F).
   참고: 단면은 날카로운 면도날과 돋보기 아래로 제작되어 두께를 약 0.5mm로 조정합니다. 균일한 두께의 섹션만 선택됩니다. 이 절차는 복잡하지 않지만 표준화에는 약간의 경험이 필요합니다.
3. 플라스틱 파이펫을 사용하여 티로드의버퍼(그림 1G)가들어 있는 1mL 튜브에 10개의 섹션을 수집합니다.
4. 직경 13mm(도1H)의인큐베이션 챔버로 섹션을 조심스럽게 옮겨주세요.
5. 버퍼를 흡인하고 5 % 마우스 혈청으로 보충 된 Tyrode의 버퍼의 30 μL로 볼륨을 조정합니다.
   참고: 이 단계에서 약리학 제가 첨가하여 프로플라틀형성에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.
6. 섹션을 멀리 배치합니다. 차원 22 x 55mm의 커버슬립으로 자체 접착제 챔버를 밀봉하십시오. 기포의 형성을 피하기 위해 고집하면서 커버 슬립을 경사(도 1I).
7. 챔버를 37°C의 가열 챔버에 놓습니다. 이 순간부터 크로노미터가 시작됩니다(T= 0h). 실험은 37°C(T= 6h)에서 6시간 동안 실행됩니다.

5. 골수 의 실시간 관찰

1. 골수 경전을 관찰하기 위해 비디오 카메라에 결합된 반전된 위상 대비 현미경(배율용 40x 렌즈)을 사용합니다. 관찰을 시작하기 전에 세포가 30 분 동안 배양하게하십시오. 관찰하는 동안 메가 카요세포가 움직이기 때문에 초점을 조정해야합니다.
   참고: 다른 관찰 모드는 (예를 들어, DIC, 메가카요세포가 내인성 형광 마커를 표현하는 마우스를 이용한 형광)이 가능하지만, 위상 조영 현미경 검사는 길고 얇은 메가카요세포 확장을 명확하게 시각화하는 것이 최적입니다. 30분 후, 골수 세포는 점차 적으로 항층층을 형성하여 병자의 주변으로 이동합니다. 1h의 배양 후, 메가카요세포는 큰 크기와 폴리로부트핵(도1J,K)으로식별될 수 있다. 인큐베이션의 3 시간 후, 메가 카요세포의 수는 증가하고 일부는 긴 확장을 가지고있다.
2. 메가카르요세포의 변신을 녹화하기 위해 동영상을 만드세요.

6. 프로플라츠판 확장 메가카요세포의 정량화

1. 인큐베이션챔버(도 1K)의각 섹션을 지역화하기 위해 맵을 그립니다.
2. 1h 후 각 섹션의 주변에 보이는 메가카요세포(즉, 거대한 폴리로부트 셀)를 식별하고 도면에 위치를 플롯합니다. 3 및 6 시간 후에이 절차를 반복하십시오.
   참고: 도면에 기초하여, 각 메가카요세포는 시간이 지남에 따라 쉽게 위치할 수 있으며, 분석된 형태의 진화(예: 크기, 변형, 프로플래틀렛 연장 등). 또 다른 가능성은 특정 탐색 소프트웨어의 사용입니다.

결과

질적 결과. 실험의 시작 부분에서, 모든 세포는 골수 단면도에서 압축됩니다. 세포가 각성의 주변에서 명확하게 보이려면 30분이 걸립니다. 메가카요세포는 큰 크기로 인식될 수 있으며, 그 진화는 시간이 지남에 따라 연구될 수 있다(크기, 모양, 동적, 프로혈소판 연장 및 혈소판 방출)(그림2A). 작은 거대 카르요세포는 직경 20에서 30 μm 사이이며, 성숙한 둥근 메?...

토론

여기에서 우리는 골수에서 성장한 프로혈소를 확장하기 위하여 거대 karyocytes의 효율성을 평가하는 간단하고 저렴한 체외 방법을 기술합니다. 마우스에 대한 골수 각질 모델은 네 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 고급 기술 기술이 필요하지 않습니다. 둘째, 메가카요세포-연장 프로플라틀을 얻는 데 필요한 시간은 매우 짧고, 절제 방법에 대해서만 6시간밖에 되지 않는데, 이는 마우스 전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270