דינמיקת היווצרות Proplatelet של מסלקי מח עצם טריים של עכבר

Summary

כאן, אנו מפרטים את שיטת הסבר מח העצם, מהכנת מדגם לניתוח שקופיות מיקרוסקופי, כדי להעריך את היכולת של מגהקריוציטים אשר הבדילו בסביבה הפיזיולוגית שלהם כדי ליצור מפיץ.

Abstract

השלב האחרון של megakaryopoiesis מוביל הרחבות ציטופלסמיות מ megakaryocytes בוגר, מה שנקרא proplatelets. הרבה נלמד על היווצרות proplatelet באמצעות מקרוציטיםבמבחנה- מובחנים; עם זאת, יש ראיות הולכות וגדלות לכך שמערכות תרבות קונבנציונליות אינן מסכמות בנאמנות את תהליך הבידול / ההתבגרות המתרחש בתוך מח העצם. בכתב יד זה, אנו מציגים שיטה מסבירה שתוארה בתחילה בשנת 1956 על ידי תיירי ובסיס לדמיין מגהקריוציטים שהבשילו בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים פוטנציאליים ופרשנויות שגויות. מח עצם טרי נאסף על ידי שטיפה של עצם הירך של עכברים, פרוסים 0.5 מ"מ חתך, ומניחים בתא דגירה ב 37 °C המכיל חיץ פיזיולוגי. מגה-קריוציטים נראים בהדרגה בפריפריה המהוללת ונצפתים עד 6 שעות תחת מיקרוסקופ הפוך בשילוב עם מצלמת וידאו. עם הזמן, megakaryocytes לשנות את צורתם, עם תאים מסוימים בעלי צורה כדורית ואחרים לפתח הרחבות עבות או הרחבת מדחפים דקים רבים עם הסתעפות נרחבת. מתבצעות חקירות איכותיות וכמותיות. שיטה זו יש את היתרון של להיות פשוט, לשחזור, ומהיר כמו megakaryocytes רבים נוכחים, ומחצית קלאסית מהם ליצור proplatelets ב 6 שעות לעומת 4 ימים עבור megakaryocytes עכבר מתורבת. בנוסף לחקר עכברים מוטנטיים, יישום מעניין של שיטה זו הוא הערכה פשוטה של הסוכנים הפרמקולוגיים על תהליך הרחבת ההתפשטות, מבלי להפריע לתהליך הבידול שעלול להתרחש בתרבויות.

Introduction

טכניקת הסבר מח העצם פותחה לראשונה על ידי תיירי ובסיס בשנת 1956 כדי לתאר את היווצרותם של תוספות ציטופלסמיות מקרוציטים של חולדה כאירוע ראשוני בהיווצרות טסיות דם¹. באמצעות ניגודיות פאזה וטכניקות קולנועיות, מחברים אלה אפיינו את הפיכתם של מגה-קריוציטים עגולים בוגרים לתאי תרומבוציטוגניים "דמויי דיונון" עם הרחבות ציטופלסמיות המציגות תנועות דינמיות של התארכות והתכווצות. זרועות אלה הופכות בהדרגה דקות יותר עד שהן הופכות לפילפורם עם נפיחות קטנה לאורך הזרועות ובקצוות. אלה התארכות megakaryocyte טיפוסי, המתקבל במבחנה ובמדיה נוזלית, יש קווי דמיון מסוימים עם טסיות דם שנצפו במח עצם קבוע, שבו megakaryocytes לבלט הרחבות ארוכות דרך קירות הסינוסואיד לתוך זרימת הדם^2,3. גילוי ושיבוט של TPO בשנת 1994, מותר להבדיל megakaryocytes בתרבות מסוגל ליצור הרחבות proplatelet הדומה לאלה המתוארים explants מח עצם^4,5,6. עם זאת, התבגרות megakaryocyte הוא הרבה פחות יעיל בתנאי תרבות, במיוחד רשת הממברנה הפנימית הנרחבת של מקרוציטים מח עצם התבגרה מפותחת במגקריוציטים מתורבתים, מה שמעכב מחקרים על המנגנונים של ביוגנזה טסיות דם^7,8.

אנו מפרטים כאן את מודל מוסף מח העצם, המבוסס על תיירי ובסיס, כדי לעקוב אחר היווצרות מפלגות בזמן אמת של מגהקריוציטים של עכברים, שהבשילו לחלוטין בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים במבחנה ופרשנויות שגויות. תוצאות המתקבלות בעכברים בוגרים מסוג בר מוצגות כדי להמחיש את היכולת של megakaryocyte להרחיב את הנפצים, המורפולוגיה שלהם ואת המורכבות של proplatelets. אנו מציגים גם אסטרטגיית כימות מהירה לאימות איכות כדי להבטיח דיוק ועמידות נתונים במהלך תהליך ההקלטה של megakaryocyte. הפרוטוקול המוצג כאן הוא הגרסה העדכנית ביותר של השיטה שפורסמה כפרק ספר בעבר⁹.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן ריאגנטים כמתואר בטבלה 1.
   1. עבור המלאי I, להמיס כל אבקה בנפרד. ודא כי osmolarity של ההכנה גבוהה מ 295 mOsm / L. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) במשך שנה אחת.
   2. להכנת המאגר של טיירוד, הפוך את הפתרון כמתואר בטבלה 1, להתאים את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים ולהוסיף 0.1 גרם D נטול מים (+) סוכרוז. התאימו ל-pH 7.3 באמצעות 1 N HCl לפי הצורך ואת האוסמולריות ל-295 mOsm/L. כדי למנוע צמיחה חיידקית, להוסיף פניצילין G בריכוז הסופי 10 U /mL סטרפטומיצין סולפט בריכוז הסופי 0.29 מ"ג/מ"ל. סנן את הפתרון הסופי באמצעות נקבוביות 0.22 מיקרומטר.

2. הכנת מערך הניסויים

1. ביום הניסוי, לחמם את המאגר של טיירוד ב 37 °C (50 °F), ולהדליק את תא החימום של המיקרוסקופ כדי להביא את הטמפרטורה ל 37 °C (50 °F).
2. הכן את כל הכלים הדרושים, כגון טיימר, תאי דגירה, מזרקי 5 מ"ל, 21 G, מלקחיים, סכין גילוח, פיפטות פסטר, מגלשות זכוכית, וצינור צנטריפוגה 15 מ"ל(איור 1A).

3. בידוד מוח העצם של העכבר

1. המת חסד C57BL /6 עכברים בגילאי 8-12 שבועות על ידי חנק CO₂ ונקע צוואר הרחם. זה צריך להיעשות במהירות על ידי אדם מוסמך ומוסמך.
2. כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי, להשרות את גוף העכבר 70% (v/v) אתנול לפני הסרת עצם הירך. השתמש במכשירים מחוטאים ב 70% אתנול עבור היצירה. לאסוף את שני עצם הירך ולנקות אותם על ידי הסרת כל רקמה דבק. לאחר טבילה מהירה באתנול, מניחים אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל חיץ טיירוד של 2 מ"ל.
3. חותכים את האפיפיזות באמצעות סכין גילוח חדה ושוטפים את מח העצם באמצעות מזרק 5 מ"ל מלא במאגר של 2 מ"ל טיירדודה. כדי להשיג זאת, הכניסו מחט 21 G לתוך פתח עצם הירך (בצד הברך) ולחצו לאט על הבוכנה כדי לאחזר גליל מח שלם(איור 1B,C). שמור את מושב איסוף מח העצם קצר ככל האפשר (פחות מ -10 דקות).

4. חלוקת מח עצם ומיקום לתא הדגירה

1. השתמש פיפטה פלסטיק 3 מ"ל להעביר בזהירות ובעדינות את מח העצם שלם על שקופית זכוכית. חשוב שהדגימות יכוסו במאגר כדי למנוע התייבשות(איור 1D).
   הערה: יש להימנע מזרימת זרימה מחדש כדי למזער מזמרות שעלולות לנתק את הרקמה.
2. תחת סטריאומיקוסקופ (10x), חתוך את קצות מח העצם שאולי נדחס בזמן השטיפה. ואז לחתוך חלקים רוחביים עם סכין גילוח חד. חלקים צריכים להיות דקים מספיק כדי לאפשר תצפית מפורטת אך להבטיח כי megakaryocytes אינם נפגעים על ידי דחיסה (בדרך כלל עובי סביב 0.5 מ"מ) (איור 1E,F).
   הערה: המקטעים מיוצרים עם סכין גילוח חד ומתחת להגדלה כדי להתאים את עובים לכ -0.5 מ"מ. רק מקטעי העובי האחיד נבחרים. הליך זה אינו מסובך אך התקינה שלו דורשת ניסיון מסוים.
3. באמצעות פיפטה מפלסטיק, אספו 10 חלקים לתוך צינור 1 מ"ל המכיל את המאגר שלטיירוד (איור 1G).
4. העבירו בזהירות את המקטעים לתא דגירה בקוטר של 13 מ"מ (איור 1H).
5. שאף את המאגר ולהתאים את עוצמת הקול ל 30 μL של המאגר של טיירוד בתוספת סרום עכבר 5 %.
   הערה: בשלב זה ניתן להוסיף סוכנים פרמקולוגיים כדי להעריך את השפעתם על היווצרות פרופלטלט.
6. מקם את המקטעים במרחק. אטמו את תא ההדבקה העצמית עם כיסוי של הממד 22 x 55 מ"מ. הטה את כיסוי תוך כדי היצמדות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר(איור 1I).
7. מניחים את התא בתא החימום ב 37 °C (50 °F). מרגע זה, הכרונומטר מופעל (T = 0 h). הניסוי פועל במשך 6 שעות ב 37 °C (T = 6 שעות).

5. התבוננות בזמן אמת של מח העצם

1. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה (עדשת פי 40 להגדלה) בשילוב למצלמת וידאו כדי לצפות בגורמי מח העצם. תן לתאים לדגור במשך 30 דקות לפני תחילת התצפית. בעת התבוננות, יש צורך להתאים את המוקד כי megakaryocytes נעים.
   הערה: מצבי תצפית אחרים אפשריים (למשל, DIC, פלואורסצנטיות באמצעות עכברים שהמקריוציטים שלהם מבטאים סמן פלואורסצנטי אנדוגני), אך מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה היא אופטימלית כדי לדמיין בבירור את הרחבות המגקריוציטים הארוכות והדקות, ומאפשרות כימות מדויק. לאחר 30 דקות, תאי מח העצם נודדים בהדרגה לפריפריה של המהולל, ויוצרים מונונייטר. לאחר שעה של דגירה, ניתן לזהות מגה-קריוציטים לפי גודלם הגדול והגרעין רב-אלובולי(איור 1J,K). לאחר 3 שעות של דגירה, מספר megakaryocytes גדל וחלקם יש הרחבות ארוכות.
2. הפוך קטעי וידאו כדי להקליט את הטרנספורמציה של megakaryocytes.

6. כימות המגקריוציטים המרחיבים את ההתפשטות

1. צייר מפה כדי להתאים כל מקטע לתא הדגירה(איור 1K).
2. לאחר שעה, זהה את המגקריוציטים הנראים לעין (כלומר, תאים פולילוביבוליים ענקיים) בפריפריה של כל קטע ושרטט את מיקומם על הציור. חזור על הליך זה לאחר 3 ו 6 שעות.
   הערה: על בסיס הציור, כל megakaryocyte יכול להיות ממוקם בקלות לאורך זמן ואת האבולוציה של המורפולוגיה שלהם נותח (למשל, גודל, עיוות, הרחבת proplatelet, וכו '). אפשרות נוספת היא שימוש בתוכנת ניווט ספציפית.

תוצאות

תוצאות איכותיות. בתחילת הניסוי, כל התאים נדחסים בסעיף מח העצם. לוקח 30 דקות עד שהתאים נראים בבירור בפריפריה של המהללים. לאחר מכן ניתן לזהות את המגקריוציטים לפי גודלם הגדול, ולאחר מכן ניתן ללמוד את התפתחותם לאורך זמן (גודל, צורה, דינמיקה, הרחבת פרופלטציה ושחרור טסיות דם)(א?...

Discussion

כאן אנו מתארים שיטת במבחנה פשוטה ובעלות נמוכה כדי להעריך את היעילות של megakaryocytes כדי להרחיב את פרופלטלטים אשר גדלו במח העצם. לדגם מסלק מח העצם לעכבר יש ארבעה יתרונות עיקריים. ראשית, אין צורך בכישורים טכניים מתקדמים. שנית, הזמן הדרוש כדי להשיג מקרוציטים מאריכים מרחיב הוא קצר למדי, רק 6 שעו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270