Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri

Özet

Burada, fizyolojik ortamlarında farklılaşmış megakaryositlerin proplatlet oluşturma yeteneğini değerlendirmek için numune hazırlamadan mikroskobik slayt analizine kadar kemik iliği eksplant yöntemini detaylandırıyoruz.

Özet

Megakaryopoezisin son aşaması, proplateletler olarak adlandırılan olgun megakaryositlerden sitoplazmik uzantılara yol açar. In vitro-farklılaştırılmışmegakaryositler kullanılarak proplatlet oluşumu hakkında çok şey öğrenilmiştir; bununla birlikte, geleneksel kültür sistemlerinin kemik iliğinin içinde gerçekleşen farklılaşma/olgunlaşma sürecini sadık bir şekilde geri almadığına dair artan bir kanıt vardır. Bu yazıda, thiéry ve Bessis tarafından 1956 yılında, kendi çevrelerinde olgunlaşmış megakaryositleri görselleştirmek, böylece potansiyel eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için açık bir yöntem sunuyoruz. Taze kemik ilikleri, farelerin uyluklarının yıkanmasıyla toplanır, 0,5 mm kesitler halinde dilimlenir ve fizyolojik tampon içeren 37 °C'de bir kuluçka odasına yerleştirilir. Megakaryositler eksiz çevrede yavaş yavaş görünür hale gelir ve bir video kameraya bağlı ters bir mikroskop altında 6 saate kadar gözlenir. Zamanla, megakaryositler şekillerini değiştirir, bazı hücreler küresel bir forma sahip ve diğerleri kalın uzantılar geliştirir veya birçok ince proplatlet geniş dallanma ile genişletir. Hem nitel hem de nicel araştırmalar yapılmaktadır. Bu yöntem, çok sayıda megakaryosit mevcut olduğu için basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir ve klasik olarak yarısı, kültürlü fare megakaryositleri için 4 güne kıyasla 6 saatte proplatelet oluşturur. Mutant farelerin çalışmasına ek olarak, bu yöntemin ilginç bir uygulaması, farmakolojik ajanların kültürlerde oluşabilecek farklılaşma sürecine müdahale etmeden proplatelet uzatma işlemi üzerinde basit bir şekilde değerlendirilmesidir.

Giriş

Kemik iliği eksplant tekniği ilk olarak 1956 yılında Thiéry ve Bessis tarafından trombosit oluşumunda ilk olay olarak sıçan megakaryosit sitoplazmik uzantılarının oluşumunu tanımlamak için geliştirilmiştir¹. Faz kontrastı ve sinematografik teknikleri kullanan bu yazarlar, olgun yuvarlak megakaryositlerin dinamik uzama ve daralma hareketlerini gösteren sitoplazmik uzantılı "kalamar benzeri" trombositojenik hücrelere dönüşümünü karakterize ettiler. Bu kollar, kollar boyunca ve uçlarda küçük şişliklerle filiform olana kadar giderek daha ince hale gelir. İn vitro ve sıvı ortamda elde edilen bu tipik megakaryosit uzamaları, megakaryositlerin sinüzoid duvarlardan kan dolaşımına uzun uzantılar gösterdiği sabit kemik iliğinde gözlenen trombositlerle belirli benzerliklere sahiptir^2,3. 1994 yılında TPO'nun keşfi ve klonlaması, kemik iliği eksplantlarında açıklananlara benzeyen proplatelet uzantıları oluşturabilen kültürdeki megakaryositlerin ayırt edilmesine izin verildi^4,5,6. Bununla birlikte, megakaryosit olgunlaşması kültür koşullarında çok daha az verimlidir, özellikle kemik iliği olgunlaşmış megakaryositlerin geniş iç zar ağı kültürlü megakaryositlerde az gelişmiştir, trombosit biyogenez mekanizmaları üzerindeki çalışmaları engeller^7,8.

Thiéry ve Bessis'e dayanan kemik iliği eksplant modelini, kendi ortamlarında tamamen olgunlaşmış fare megakaryositlerinin gerçek zamanlı proplatlet oluşumunda takip etmek, böylece olası in vitro eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için detaylandırırız. Vahşi tip yetişkin farelerde elde edilen sonuçlar, megakaryositlerin proplateletleri genişletme yeteneğini, morfolojilerini ve proplateletlerin karmaşıklığını göstermek için sunulmuştur. Ayrıca megakaryosit kayıt sürecinde veri doğruluğu ve sağlamlığı sağlamak için kalite doğrulaması için hızlı bir niceleme stratejisi sunuyoruz. Burada sunulan protokol, daha önce kitap bölümü olarak yayınlanan yöntemin en son sürümüdür⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Tablo 1'de açıklandığı gibi reaktifleri hazırlayın.
   1. Stok I için her tozu ayrı ayrı çözün. Preparatın osmolaritesinin 295 mOsm/L'den yüksek olduğundan emin olun. Bu çözelti bir yıl boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   2. Tyrode'un tampon hazırlığı için, çözeltiyi Tablo 1'deaçıklandığı gibi yapın, hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye ayarlayın ve 0,1 g susuz D (+) sakkaroz ekleyin. Gerektiğinde 1 N HCl ve osmolarite kullanarak pH 7.3'e 295 mOsm/L'ye ayarlayın. Bakteri üremesini önlemek için 10 U/mL son konsantrasyonda penisilin G ve 0,29 mg/mL son konsantrasyonda streptomisin sülfat ekleyin. Son çözeltiyi 0,22 μm gözeneklerle filtreleyin.

2. Deneysel kurulumun hazırlanması

1. Deney günü, Tirodun tamponu 37 ° C'de ısıtın ve sıcaklığı 37 ° C'ye getirmek için mikroskobun ısıtma odasını açın.
2. Zamanlayıcı, kuluçka odaları, 5 mL şırıng, 21 G, forseps, jilet, Pasteur pipetler, cam kaydıraklar ve 15 mL santrifüj tüpü gibi gerekli tüm araçları hazırlayın(Şekil 1A).

3. Fare kemik iliğinin izolasyonu

1. Co₂ boğulma ve servikal çıkık ile 8-12 haftalık C57BL/6 fareleri ötenazi. Bu, yetkin ve nitelikli bir kişi tarafından hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
2. Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için, uyluk kemiğini çıkarmadan önce fare gövdesini% 70 (v / v) etanol içine batırın. Diseksiyon için% 70 etanolde dezenfekte edilmiş aletler kullanın. İki uyluk kemiğini toplayın ve herhangi bir yapışık dokuyu çıkararak temizleyin. Etanolde hızlı daldırmadan sonra, 2 mL Tyrode tamponu içeren 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Keskin bir jilet kullanarak epifizleri kesin ve 2 mL Tyrdode tamponu ile dolu 5 mL şırınna kullanarak kemik iliğini yıkayın. Bunu başarmak için, uyluk kemiğinin açıklığı içine 21 G'lik bir iğne takın (diz tarafında) ve sağlam bir ilik silindiri almak için pistona yavaşça basın (Şekil 1B, C). İlik toplama seansını mümkün olduğunca kısa tutun (10 dakikanın altında).

4. Kemik iliği kesiti ve inkübasyon odasına yerleştirilmesi

1. Sağlam kemik iliğini dikkatlice ve hafifçe cam bir kaydırağa aktarmak için 3 mL plastik pipet kullanın. Kurumasını önlemek için numunelerin tamponla kaplanması önemlidir (Şekil 1D).
   NOT: Dokuyu ayrıştırabilecek kesmeleri en aza indirmek için akış yeniden akışından kaçının.
2. Stereomikroskop (10x) altında, yıkama sırasında sıkıştırılmış olabilecek iliğin uçlarını kesin. Daha sonra keskin bir jiletle transversal bölümleri kesin. Bölümler ayrıntılı bir gözleme izin vermek için yeterince ince olmalı, ancak megakaryositlerin sıkıştırmadan zarar görmemesini sağlamalıdır (genellikle 0,5 mm civarında kalınlık) (Şekil 1E,F).
   NOT: Bölümler keskin bir jiletle ve kalınlıklarını yaklaşık 0,5 mm'ye ayarlamak için bir büyüteç altında yapılır. Sadece tekdüze kalınlıkta bölümler seçilir. Bu prosedür karmaşık değildir, ancak standardizasyonu biraz deneyim gerektirir.
3. Plastik bir pipet kullanarak, Tirode tamponu içeren 1 mL tüpe 10 bölüm toplayın (Şekil 1G).
4. Bölümleri dikkatlice 13 mm çapında bir kuluçka odasına aktarın(Şekil 1H).
5. Tamponu epire edin ve hacmi % 5 fare serumu ile desteklenmiş 30 μL Tyrode tamponu olarak ayarlayın.
   NOT: Bu aşamada farmakolojik ajanlar eklenerek proplatlet oluşumu üzerindeki etkileri değerlendirilebilir.
6. Bölümleri mesafeye yerleştirin. Kendinden yapışkanlı hazneyi 22 x 55 mm boyutunda bir kapakla kapatın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yapışırken kapak sapını eğimli hale(Şekil 1I).
7. Odayı 37 °C'de ısıtma odasına yerleştirin. Şu andan itibaren kronometre başlatılır (T= 0 h). Deney 37 °C'de (T= 6 h) 6 saat çalışır.

5. İlik eksplantlarının gerçek zamanlı gözlemi

1. Kemik iliğinin eksplantlarını gözlemlemek için bir video kameraya bağlı ters faz kontrast mikroskobu (büyütme için 40x lens) kullanın. Gözleme başlamadan önce hücrelerin 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Gözlemlerken, odağı ayarlamak gerekir, çünkü megakaryositler hareket eder.
   NOT: Diğer gözlem modları mümkündür (örneğin, megakaryositleri endojen bir floresan işaretleyiciyi ifade eden fareler kullanılarak DIC, floresan), ancak faz kontrastı mikroskopisi, uzun ve ince megakaryosit uzantılarını net bir şekilde görselleştirmek için en uygun olanıdır ve kesin niceleme sağlar. 30 dakika sonra, ilik hücreleri yavaş yavaş eksizyonun çevresine göç ederek bir monolayer oluşturur. 1 saat inkübasyondan sonra, megakaryositler büyük boyutları ve polilobulated çekirdekleri ile tanımlanabilir (Şekil 1J,K). 3 saat inkübasyondan sonra, megakaryositlerin sayısı artar ve bazılarının uzun uzantıları vardır.
2. Megakaryositlerin dönüşümlerini kaydetmek için videolar yapın.

6. Proplatelet uzatan megakaryositlerin nicelleştirilmesi

1. Kuluçka odasındaki her bölümü yerelleştirmek için bir harita çizin (Şekil 1K).
2. 1 saat sonra, her bölümün çevresindeki görünür megakaryositleri (yani dev polilobulated hücreleri) tanımlayın ve çizimdeki konumlarını çizin. Bu işlemi 3 ve 6 saat sonra tekrarlayın.
   NOT: Çizime dayanarak, her megakaryosit zaman içinde kolayca bulunabilir ve morfolojilerinin evrimi analiz edilebilir (ör. boyut, deformasyon, proplatlet uzantısı vb.). Başka bir olasılık, belirli bir navigasyon yazılımının kullanılmasıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Nitel sonuçlar. Deneyin başında tüm hücreler kemik iliği bölümünde sıkıştırılıyor. Hücrelerin eksplantların çevresinde net bir şekilde görünür hale gelmesi 30 dakika sürer. Megakaryositler daha sonra büyük boyutlarıyla tanınabilir ve evrimleri zamanla incelenebilir (boyut, şekil, dinamik, proplatlet uzantısı ve trombosit salınımı) (Şekil 2A). Küçük megakaryositlerin çapı 20 ila 30 μm arasındadır ve çekirdekleri polilobulated iken ol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, kemik iliğinde yetişen proplateletleri genişletmek için megakaryositlerin verimliliğini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. Fare için kemik iliği eksplant modelinin dört ana avantajı vardır. İlk olarak, gelişmiş teknik becerilere gerek yoktur. İkincisi, megakaryosit uzatıcı proplateletler elde etmek için gereken süre oldukça kısadır, eksplant yöntemi için sadece 6 saattir, fare atalarından başlayan geleneksel bir kültür yönte...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270