Dynamique de formation proplaquettaire des explants de moelle osseuse fraîche de souris

Résumé

Ici, nous détaillons la méthode d’explantation de moelle osseuse, de la préparation de l’échantillon à l’analyse microscopique des lames, afin d’évaluer la capacité des mégacaryocytes qui se sont différenciés dans leur environnement physiologique à former des proplaquettaires.

Résumé

La dernière étape de la mégacarylopoïèse conduit à des extensions cytoplasmiques à partir de mégacaryocytes matures, appelés proplaquettaires. On a beaucoup appris sur la formation de proplaquettaires à l’aide de mégacaryocytes différenciés in vitro; cependant, il existe de plus en plus de preuves que les systèmes de culture conventionnels ne récapitulent pas fidèlement le processus de différenciation/maturation qui a lieu à l’intérieur de la moelle osseuse. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode d’explantation initialement décrite en 1956 par Thiéry et Bessis pour visualiser les mégacaryocytes qui ont mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi les artefacts potentiels et les mauvaises interprétations. Les moelles osseuses fraîches sont collectées en rinçant les fémurs des souris, tranchées en sections transversales de 0,5 mm et placées dans une chambre d’incubation à 37 °C contenant un tampon physiologique. Les mégacaryocytes deviennent progressivement visibles à la périphérie de l’explantation et sont observés jusqu’à 6 heures sous un microscope inversé couplé à une caméra vidéo. Au fil du temps, les mégacaryocytes changent de forme, certaines cellules ayant une forme sphérique et d’autres développant des extensions épaisses ou étendant de nombreuses proplaquettaires minces avec une ramification étendue. Des enquêtes qualitatives et quantitatives sont menées. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide car de nombreux mégacaryocytes sont présents, et classiquement la moitié d’entre eux forment des proplaquettaires en 6 heures contre 4 jours pour les mégacaryocytes de souris en culture. En plus de l’étude de souris mutantes, une application intéressante de cette méthode est l’évaluation simple des agents pharmacologiques sur le processus d’extension proplaquettaire, sans interférer avec le processus de différenciation qui peut se produire dans les cultures.

Introduction

La technique de l’explantation de moelle osseuse a été développée pour la première fois par Thiéry et Bessis en 1956 pour décrire la formation d’extensions cytoplasmiques mégacaryocytaires de rat comme un événement initial dans la formation de plaquettes¹. En utilisant le contraste de phase et des techniques cinématographiques, ces auteurs ont caractérisé la transformation de mégacaryocytes ronds matures en cellules thrombocytogènes « semblables à des calmars » avec des extensions cytoplasmiques montrant des mouvements dynamiques d’allongement et de contraction. Ces bras deviennent progressivement plus minces jusqu’à ce qu’ils deviennent filiformes avec de petits gonflements le long des bras et aux extrémités. Ces allongements typiques des mégacaryocytes, obtenus in vitro et en milieu liquide, présentent certaines similitudes avec les plaquettes observées dans la moelle osseuse fixe, où les mégacaryocytes dépassent de longues extensions à travers les parois sinusoïdales dans la circulation sanguine^2,3. La découverte et le clonage du TPO en 1994, ont permis de différencier les mégacaryocytes en culture capables de former des extensions proplaquettaires ressemblant à celles décrites dans les explantes de moelle osseuse^4,5,6. Cependant, la maturation des mégacaryocytes est beaucoup moins efficace dans les conditions de culture, notamment le vaste réseau membranaire interne des mégacaryocytes matures de la moelle osseuse est sous-développé dans les mégacaryocytes en culture, entravant les études sur les mécanismes de la biogenèse plaquettaire^7,8.

Nous détaillons ici le modèle d’explantation de moelle osseuse, basé sur Thiéry et Bessis, à suivre en temps réel la formation de proplaquettaires de mégacaryocytes de souris, qui ont complètement mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi d’éventuels artefacts in vitro et des interprétations erronées. Les résultats obtenus chez des souris adultes de type sauvage sont présentés pour illustrer la capacité des mégacaryocytes à étendre les proplaquettaires, leur morphologie et la complexité des proplaquettaires. Nous introduisons également une stratégie de quantification rapide pour la validation de la qualité afin d’assurer l’exactitude et la robustesse des données pendant le processus d’enregistrement des mégacaryocytes. Le protocole présenté ici est la version la plus récente de la méthode publiée sous la forme d’un chapitre de livre précédemment⁹.

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Protocole

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Préparation des réactifs

1. Préparer les réactifs comme décrit dans le tableau 1.
   1. Pour le Stock I, dissoudre chaque poudre séparément. S’assurer que l’osmolarité de la préparation est supérieure à 295 mOsm/L. Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant un an.
   2. Pour la préparation tampon du Tyrode, faire la solution comme décrit dans le tableau 1,régler le volume à 100 mL avec de l’eau distillée et ajouter 0,1 g de saccharose D (+) anhydre. Ajuster à un pH de 7,3 à l’aide de 1 N HCl au besoin et de l’osmolarité à 295 mOsm/L. Pour prévenir la croissance bactérienne, ajouter la pénicilline G à la concentration finale de 10 U/mL et le sulfate de streptomycine à la concentration finale de 0,29 mg/mL. Filtrer la solution finale à travers des pores de 0,22 μm.

2. Préparation du dispositif expérimental

1. Le jour de l’expérience, réchauffez le tampon du Tyrode à 37 °C et allumez la chambre chauffante du microscope pour porter la température à 37 °C.
2. Préparez tous les outils nécessaires, tels qu’une minuterie, des chambres d’incubation, des seringues de 5 mL, 21 G, une pince, une lame de rasoir, des pipettes Pasteur, des lames en verre et un tube de centrifugeuse de 15 mL(Figure 1A).

3. Isolement de la moelle osseuse de la souris

1. Euthanasier des souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines par asphyxie au CO₂ et luxation cervicale. Cela devrait être fait rapidement par une personne compétente et qualifiée.
2. Pour éviter la contamination microbienne, trempez le corps de la souris dans de l’éthanol à 70 % (v/v) avant de retirer les fémurs. Utilisez des instruments désinfectés dans de l’éthanol à 70% pour la dissection. Recueillez les deux fémurs et nettoyez-les en enlevant tout tissu adhérent. Après immersion rapide dans l’éthanol, placez-les dans un tube centrifuge de 15 mL contenant 2 mL de tampon tyrode.
3. Coupez les épiphyses à l’aide d’une lame de rasoir tranchante et rincez la moelle osseuse à l’aide d’une seringue de 5 mL remplie de 2 mL de tampon Tyrdode. Pour ce faire, introduisez une aiguille de 21 G dans l’ouverture du fémur (du côté du genou) et appuyez lentement sur le piston pour récupérer un cylindre de moelle intact(Figure 1B,C). Gardez la séance de collecte de moelle osseuse aussi brève que possible (moins de 10 min).

4. Sectionnement et placement de la moelle osseuse dans la chambre d’incubation

1. Utilisez une pipette en plastique de 3 mL pour transférer soigneusement et doucement la moelle osseuse intacte sur une lame de verre. Il est important que les échantillons soient recouverts d’un tampon pour éviter le dessèchement(Figure 1D).
   REMARQUE: Évitez le flux-reflux pour minimiser les cisailles qui pourraient dissocier le tissu.
2. Sous un stéréomicroscope (10x), coupez les extrémités de la moelle qui peuvent avoir été comprimées au moment de la chasse d’eau. Coupez ensuite des sections transversales avec une lame de rasoir tranchante. Les sections doivent être suffisamment fines pour permettre une observation détaillée, mais s’assurer que les mégacaryocytes ne sont pas endommagés par la compression (généralement une épaisseur d’environ 0,5 mm)(Figure 1E,F).
   REMARQUE: Les sections sont faites avec une lame de rasoir tranchante et sous une loupe pour ajuster leur épaisseur à environ 0,5 mm. Seules les sections d’épaisseur uniforme sont sélectionnées. Cette procédure n’est pas compliquée mais sa standardisation nécessite une certaine expérience.
3. À l’aide d’une pipette en plastique, recueillir 10 sections dans un tube de 1 mL contenant le tampon de Tyrode(Figure 1G).
4. Transférer soigneusement les sections dans une chambre d’incubation d’un diamètre de 13 mm(Figure 1H).
5. Aspirer le tampon et régler le volume à 30 μL du tampon de Tyrode complété par 5 % de sérum de souris.
   NOTE: C’est à ce stade que des agents pharmacologiques peuvent être ajoutés pour évaluer leur impact sur la formation de proplaquettaires.
6. Positionnez les sections à distance. Scellez la chambre auto-adhésive avec un couvercle de dimension 22 x 55 mm. Inclinez le couvercle tout en collant pour éviter la formation de bulles d’air (Figure 1I).
7. Placez la chambre dans la chambre de chauffage à 37 °C. À partir de ce moment, le chronomètre est démarré (T = 0 h). L’expérience dure 6 h à 37 °C (T= 6 h).

5. Observation en temps réel des explants de moelle osseuse

1. Utilisez un microscope à contraste de phase inversé (lentille 40x pour le grossissement) couplé à une caméra vidéo pour observer les explants de moelle osseuse. Laissez les cellules incuber pendant 30 min avant de commencer l’observation. En observant, il est nécessaire d’ajuster la mise au point car les mégacaryocytes se déplacent.
   REMARQUE: D’autres modes d’observation sont possibles (par exemple, DIC, fluorescence utilisant des souris dont les mégacaryocytes expriment un marqueur fluorescent endogène), mais la microscopie à contraste de phase est optimale pour visualiser clairement les extensions de mégacaryocytes longues et minces, permettant une quantification précise. Après 30 min, les cellules de la moelle migrent progressivement vers la périphérie de l’explante, formant une monocouche. Après 1 h d’incubation, les mégacaryocytes peuvent être identifiés par leur grande taille et leurs noyaux polylobulés (Figure 1J,K). Après 3 h d’incubation, le nombre de mégacaryocytes augmente et certains ont de longues extensions.
2. Faites des vidéos pour enregistrer la transformation des mégacaryocytes.

6. Quantification des mégacaryocytes proplaquettaires

1. Dessinez une carte pour localiser chaque section dans la chambre d’incubation (Figure 1K).
2. Après 1 h, identifiez les mégacaryocytes visibles (c’est-à-dire les cellules polylobulées géantes) à la périphérie de chaque section et tracez leurs positions sur le dessin. Répétez cette procédure après 3 et 6 h.
   NOTE: Sur la base du dessin, chaque mégacaryocyte peut être facilement localisé au fil du temps et l’évolution de leur morphologie analysée (par exemple, taille, déformation, extension proplaquettaire, etc.). Une autre possibilité est l’utilisation d’un logiciel de navigation spécifique.

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Résultats

Résultats qualitatifs. Au début de l’expérience, toutes les cellules sont compactées dans la section de la moelle osseuse. Il faut 30 min pour que les cellules deviennent clairement visibles à la périphérie des explants. Les mégacaryocytes sont alors reconnaissables à leur grande taille et leur évolution peut ensuite être étudiée dans le temps (taille, forme, dynamique, extension proplaquettaire et libération plaquettaire)(Figure 2A). Les petits mégacaryocyt...

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Discussion

Nous décrivons ici une méthode in vitro simple et peu coûteuse pour évaluer l’efficacité des mégacaryocytes pour étendre les proplaquettaires qui se sont développées dans la moelle osseuse. Le modèle d’explantation de moelle osseuse pour souris présente quatre avantages principaux. Tout d’abord, aucune compétence technique avancée n’est requise. Deuxièmement, le temps nécessaire pour obtenir des proplaquettaires étendant les mégacaryocytes est assez court, seulement 6 heures pour la mét...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270