Dinamica di formazione dei proplatelet degli espianti di midollo osseo fresco del topo

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio il metodo di espianto del midollo osseo, dalla preparazione del campione all'analisi microscopica del vetrino, per valutare la capacità dei megacariociti che si sono differenziati nel loro ambiente fisiologico di formare proplatelet.

Abstract

L'ultimo stadio della megacariopoiesi porta a estensioni citoplasmatiche da megacariociti maturi, i cosiddetti proplatelets. Molto è stato appreso sulla formazione di proplatelet utilizzando megacariociti differenziati in vitro; tuttavia, vi è una crescente evidenza che i sistemi di coltura convenzionali non ricapitolano fedelmente il processo di differenziazione / maturazione che avviene all'interno del midollo osseo. In questo manoscritto, presentiamo un metodo di espianto inizialmente descritto nel 1956 da Thiéry e Bessis per visualizzare i megacariociti che sono maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così potenziali artefatti e interpretazioni errate. I midollo osseo fresco vengono raccolti lavando i femori dei topi, tagliati in sezioni trasversali di 0,5 mm e posti in una camera di incubazione a 37 °C contenente un tampone fisiologico. I megacariociti diventano gradualmente visibili alla periferia dell'espianto e vengono osservati fino a 6 ore sotto un microscopio invertito accoppiato a una videocamera. Nel corso del tempo, i megacariociti cambiano forma, con alcune cellule che hanno una forma sferica e altre che sviluppano estensioni spesse o estendono molte proplatelet sottili con un'ampia ramificazione. Vengono effettuate indagini sia qualitative che quantitative. Questo metodo ha il vantaggio di essere semplice, riproducibile e veloce in quanto sono presenti numerosi megacariociti, e classicamente la metà di essi forma proplatelet in 6 ore rispetto ai 4 giorni per i megacariociti di topo in coltura. Oltre allo studio dei topi mutanti, un'applicazione interessante di questo metodo è la semplice valutazione degli agenti farmacologici sul processo di estensione del proplatelet, senza interferire con il processo di differenziazione che può verificarsi nelle colture.

Introduzione

La tecnica di espianto del midollo osseo è stata sviluppata per la prima volta da Thiéry e Bessis nel 1956 per descrivere la formazione di estensioni citoplasmatiche dei megacariociti di ratto come un evento iniziale nella formazione piastrinica¹. Utilizzando il contrasto di fase e le tecniche cinematografiche, questi autori hanno caratterizzato la trasformazione di megacariociti rotondi maturi in cellule trombocitogeniche "simili a calamari" con estensioni citoplasmatiche che mostrano movimenti dinamici di allungamento e contrazione. Queste braccia diventano progressivamente più sottili fino a diventare filiformi con piccoli gonfiori lungo le braccia e sulle punte. Questi tipici allungamenti dei megacariociti, ottenuti in vitro e in mezzi liquidi, hanno alcune somiglianze con le piastrine osservate nel midollo osseo fisso, dove i megacariociti sporgono lunghe estensioni attraverso le pareti sinusoidi nella circolazione sanguigna^2,3. La scoperta e la clonazione del TPO nel 1994, ha permesso di differenziare i megacariociti in coltura in grado di formare estensioni di proplatelet simili a quelle descritte negli espianti di midollo osseo^4,5,6. Tuttavia, la maturazione dei megacariociti è molto meno efficiente in condizioni di coltura, in particolare la vasta rete di membrane interne di megacariociti maturi del midollo osseo è sottosviluppata nei megacariociti in coltura, ostacolando gli studi sui meccanismi della biogenesi piastrinica^7,8.

Descriviamo qui il modello di espianto del midollo osseo, basato su Thiéry e Bessis, per seguire in tempo reale la formazione di proplatelet di megacariociti di topo, che sono completamente maturati nel loro ambiente nativo, aggirando così possibili artefatti in vitro e interpretazioni errate. I risultati ottenuti in topi adulti wild-type sono presentati per illustrare la capacità dei megacariociti di estendere i proplatelet, la loro morfologia e la complessità dei proplatelet. Introduciamo anche una strategia di quantificazione rapida per la convalida della qualità per garantire l'accuratezza e la robustezza dei dati durante il processo di registrazione dei megacariociti. Il protocollo qui presentato è la versione più recente del metodo pubblicato come libro capitolo precedentemente⁹.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare i reagenti come descritto nella Tabella 1.
   1. Per lo Stock I, sciogliere ogni polvere separatamente. Assicurarsi che l'osmolarità del preparato sia superiore a 295 mOsm/L. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per un anno.
   2. Per la preparazione del tampone di Tyrode, preparare la soluzione come descritto nella Tabella 1, regolare il volume a 100 ml con acqua distillata e aggiungere 0,1 g di saccarosio D (+) anidro. Regolare a pH 7,3 utilizzando 1 N HCl secondo necessità e l'osmolarità a 295 mOsm/L. Per prevenire la crescita batterica, aggiungere la penicillina G alla concentrazione finale di 10 U/mL e la streptomicina solfato alla concentrazione finale di 0,29 mg/mL. Filtrare la soluzione finale attraverso pori da 0,22 μm.

2. Preparazione dell'allestimento sperimentale

1. Il giorno dell'esperimento, riscaldare il tampone di Tyrode a 37 °C e accendere la camera di riscaldamento del microscopio per portare la temperatura a 37 °C.
2. Preparare tutti gli strumenti necessari, come timer, camere di incubazione, siringhe da 5 mL, 21 G, pinna, lama di rasoio, pipette Pasteur, vetrini e tubo centrifuga da 15 ml (Figura 1A).

3. Isolamento del midollo osseo del topo

1. Eutanasia di topi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane per asfissia di CO₂ e lussazione cervicale. Questo dovrebbe essere fatto rapidamente da una persona competente e qualificata.
2. Per evitare la contaminazione microbica, immergere il corpo del topo in etanolo al 70% (v / v) prima di rimuovere i femori. Utilizzare strumenti disinfettati al 70% in etanolo per la dissezione. Raccogliere i due femori e pulirli rimuovendo qualsiasi tessuto aderente. Dopo una rapida immersione in etanolo, metterli in un tubo centrifugo da 15 mL contenente 2 mL di tampone tyrode.
3. Tagliare via le epifisi usando una lama affilata e lavare il midollo osseo usando una siringa da 5 mL riempita con tampone di Tyrdode da 2 mL. Per raggiungere questo obiettivo, introdurre un ago da 21 G nell'apertura del femore (sul lato del ginocchio) e premere lentamente lo stantuffo per recuperare un cilindro del midollo intatto (Figura 1B,C). Mantenere la sessione di raccolta del midollo il più breve possibile (meno di 10 minuti).

4. Sezionamento del midollo osseo e posizionamento nella camera di incubazione

1. Utilizzare una pipetta di plastica da 3 ml per trasferire con cura e delicatezza il midollo osseo intatto su un vetrino. È importante che i campioni siano coperti con tampone per evitare l'essiccazione (Figura 1D).
   NOTA: evitare il riflusso del flusso per ridurre al minimo le cesoie che potrebbero dissociare il tessuto.
2. Sotto uno stereomicroscopio (10x), tagliare le estremità del midollo che potrebbero essere state compresse al momento del risciacquo. Quindi tagliare sezioni trasversali con una lama di rasoio affilata. Le sezioni dovrebbero essere abbastanza sottili da consentire un'osservazione dettagliata, ma garantire che i megacariociti non siano danneggiati dalla compressione (di solito spessore intorno a 0,5 mm) (Figura 1E, F).
   NOTA: Le sezioni sono realizzate con una lama di rasoio affilata e sotto una lente d'ingrandimento per regolare il loro spessore a circa 0,5 mm. Vengono selezionate solo le sezioni di spessore uniforme. Questa procedura non è complicata ma la sua standardizzazione richiede una certa esperienza.
3. Utilizzando una pipetta di plastica, raccogliere 10 sezioni in 1 mL di tubo contenente il buffer di Tyrode (Figura 1G).
4. Trasferire con cura le sezioni in una camera di incubazione con un diametro di 13 mm (Figura 1H).
5. Aspirare il tampone e regolare il volume a 30 μL del tampone di Tyrode integrato con il 5 % di siero di topo.
   NOTA: È in questa fase che possono essere aggiunti agenti farmacologici per valutare il loro impatto sulla formazione di proplatelet.
6. Posizionate le sezioni a distanza. Sigillare la camera autoadesiva con un coperchio di dimensioni 22 x 55 mm. Inclinare il coperchio mentre si attacca per evitare la formazione di bolle d'aria (Figura 1I).
7. Posizionare la camera nella camera di riscaldamento a 37 °C. Da questo momento, il cronometro viene avviato (T = 0 h). L'esperimento dura 6 ore a 37 °C (T= 6 h).

5. Osservazione in tempo reale degli espianti del midollo

1. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertita (obiettivo 40x per l'ingrandimento) accoppiato a una videocamera per osservare gli espianti del midollo osseo. Lasciare incubare le cellule per 30 minuti prima di iniziare l'osservazione. Durante l'osservazione, è necessario regolare la messa a fuoco perché i megacariociti si muovono.
   NOTA: Sono possibili altre modalità di osservazione (ad esempio, DIC, fluorescenza utilizzando topi i cui megacariociti esprimono un marcatore fluorescente endogeno), ma la microscopia a contrasto di fase è ottimale per visualizzare chiaramente le estensioni dei megacariociti lunghi e sottili, consentendo una quantificazione precisa. Dopo 30 minuti, le cellule del midollo migrano gradualmente verso la periferia dell'impianto, formando un monostrato. Dopo 1 ora di incubazione, i megacariociti possono essere identificati dalle loro grandi dimensioni e dai nuclei polilobulati (Figura 1J, K). Dopo 3 ore di incubazione, il numero di megacariociti aumenta e alcuni hanno lunghe estensioni.
2. Realizza video per registrare la trasformazione dei megacariociti.

6. Quantificazione dei megacariociti che estendono la proplateleta

1. Disegnare una mappa per localizzare ogni sezione nella camera di incubazione (Figura 1K).
2. Dopo 1 ora, identificare i megacariociti visibili (cioè cellule polilobulate giganti) alla periferia di ogni sezione e tracciare le loro posizioni sul disegno. Ripetere questa procedura dopo 3 e 6 ore.
   NOTA: Sulla base del disegno, ogni megacariocita può essere facilmente localizzato nel tempo e analizzata l'evoluzione della loro morfologia (es. dimensioni, deformazione, estensione del proplatelet, ecc.). Un'altra possibilità è l'utilizzo di uno specifico software di navigazione.

Risultati

Risultati qualitativi. All'inizio dell'esperimento, tutte le cellule vengono compattate nella sezione del midollo osseo. Ci vogliono 30 minuti perché le cellule diventino chiaramente visibili alla periferia degli espianti. I megacariociti sono quindi riconoscibili per le loro grandi dimensioni e la loro evoluzione può quindi essere studiata nel tempo (dimensioni, forma, dinamica, estensione del proplatelet e rilascio piastrinico) (Figura 2A). I piccoli megacariociti hanno ...

Discussione

Qui descriviamo un metodo in vitro semplice e a basso costo per valutare l'efficienza dei megacariociti per estendere i proplatelet che sono cresciuti nel midollo osseo. Il modello di espianto del midollo osseo per il topo ha quattro vantaggi principali. In primo luogo, non sono richieste competenze tecniche avanzate. In secondo luogo, il tempo necessario per ottenere proplatelet che estendono i megacariociti è piuttosto breve, solo 6 ore per il metodo di espianto, rispetto a un minimo di 4 giorni per un metodo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
21-gauge needles	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Incubation Chambers	Electron Microscopy Sciences	70324-02	Depth : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH adjusted to 7.5
Human serum albumin	VIALEBEX	authorized medication : n° 3400956446995	20% (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72200-40	22 mm x 55 mm
Microscope	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	DMI8 - 514341	air lens
microscope camera	Leica Microsystems SA, Westlar, Germany	K5 CMS GmbH -14401137	image resolution : 4.2 megapixel
Mouse serum	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4.H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Razor blade	Electron Microscopy Sciences	72000
Sucrose D (+)	Sigma	G8270