Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

Resumen

Este artículo tiene como objetivo presentar un protocolo para la preparación de endosomas de reciclaje de células de mamíferos utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa.

Resumen

El tráfico endosomal es un proceso celular esencial que regula una amplia gama de eventos biológicos. Las proteínas se internalizan desde la membrana plasmática y luego se transportan a los endosomas tempranos. Las proteínas internalizadas podrían ser transitadas al lisosoma para su degradación o recicladas de vuelta a la membrana plasmática. Se requiere una vía de reciclaje endocítica robusta para equilibrar la eliminación de materiales de membrana de la endocitosis. Se informa que varias proteínas regulan la vía, incluido el factor de ribosilación ADP 6 (ARF6). La ultracentrifugación por gradiente de densidad es un método clásico para el fraccionamiento celular. Después de la centrifugación, los orgánulos se sedimentan en su superficie isopícnica. Las fracciones se recogen y se utilizan para otras aplicaciones posteriores. Aquí se describe un protocolo para obtener una fracción de reciclaje que contiene endosomas de células de mamíferos transfectadas utilizando ultracentrifugación por gradiente de densidad. Las fracciones aisladas fueron sometidas a Western blotting estándar para analizar su contenido proteico. Al emplear este método, identificamos que la orientación de la membrana plasmática de la envoltura y la motilidad celular 1 (ELMO1), un sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1) factor de intercambio de nucleótidos de guanina, es a través del reciclaje endocítico mediado por ARF6.

Introducción

El tráfico endosomal es un proceso fisiológico esencial que implica diversos eventos biológicos^1,por ejemplo, el transporte de receptores de señalización, canales iónicos y moléculas de adhesión. Las proteínas localizadas en la membrana plasmática se internalizan por^{endocitosis 2}. Las proteínas internalizadas se clasifican por el endosoma temprano³. Algunas de las proteínas están dirigidas a los lisosomas para su degradación⁴. Sin embargo, una cantidad significativa de proteínas se reciclan de vuelta a la superficie celular mediante procesos de reciclaje rápido y reciclaje lento. En el reciclaje rápido, las proteínas abandonan los endosomas tempranos y regresan directamente a la membrana plasmática. Por el contrario, en el reciclaje lento, las proteínas se clasifican primero al compartimiento de reciclaje endocítico y luego se transportan de regreso a la membrana plasmática. Varias proteínas de carga, por ejemplo, clatrina, complejo de retrómeros, complejo retriever y proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, y complejo SCAR Homologue (WASH), participan en tales procesos de reciclaje de^{membranas 4,5,6,7,8,9}. El equilibrio del evento de endocitosis y reciclaje es crucial para la supervivencia celular y contribuye a varios eventos celulares^10,por ejemplo, la adhesión celular, la migración celular, la polaridad celular y la transducción de señales.

ARF6, una pequeña GTPasa, es un regulador reportado del tráfico endocítico^7,11,12. De interés, diversos grupos de investigación han ilustrado la importancia de ARF6 en el reciclaje endocítico^{13,14,15,16,17.} El estudio tiene como objetivo investigar la relación entre el crecimiento de neuritas mediado por ARF6 y el reciclaje endocítico. El informe anterior sugiere que la activación de ARF6 es aguas arriba de la actividad de Rac1 al actuar sobre ELMO1-dedicador del complejo citocinesis 1 (DOCK180)^18. Sin embargo, la forma en que ARF6 desencadena la señalización Rac1 mediada por ELMO1-DOCK180 sigue sin estar clara. Se empleó la ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el papel del reciclaje endocítico mediado por ARF6 en dicho proceso. Mediante el uso de esto, la fracción que contiene endosoma de reciclaje se obtuvo a partir de lisados celulares¹⁹. La fracción fue sometida a Western blotting para el análisis del contenido de proteínas. Los resultados de immunoblot revelaron que bajo la presencia de FE65, una proteína adaptadora enriquecida con cerebro, ARF6 activo aumentó sustancialmente el nivel de ELMO1 en la fracción que contiene endosomas de reciclaje. El siguiente protocolo incluye los procedimientos para (1) transfectar células de mamíferos; (2) preparación de las muestras y columnas de gradiente de densidad; y (3) la obtención de la fracción que contiene endosoma de reciclaje.

Protocolo

1. Cultivo y transfección de células de mamíferos

1. Placa 2 x 10⁶ celdas en una placa de cultivo de 100 mm. Use cuatro platos para cada transfección.
   NOTA: El número de celdas necesarias puede variar para diferentes líneas celulares. La optimización puede ser necesaria antes de proceder al paso de aislamiento.
2. Al día siguiente, transfecte las células con lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Cosecha de células

1. Desechar el medio de cultivo 48 h después de la transfección.
2. Lave las células con PBS helado (fosfatos de sodio de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro de sodio de 140 mM) dos veces.
3. Agregue 1 ml de PBS⁺ helado (PBS suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa 0.5x y cóctel inhibidor de la fosfatasa 0.5x) a cada plato.
4. Recoja las células con un raspador celular y transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 ml.
5. Pellet las células por centrifugación utilizando un rotor de cucharón oscilante a 400 x g durante 5 min.
6. Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular suavemente en 5 ml de tampón de homogeneización (HB; 250 mM de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM de EDTA suplementado con 0.03 mM de cicloheximida, 1x cóctel inhibidor de la proteasa y 1x cóctel inhibidor de la fosfatasa).
7. Recoger las células por centrifugación a 1.300 x g durante 10 min.
8. Resuspend el pellet celular en 1 mL de HB.
9. Homogeneizar las células con un homogeneizador Dounce para 15-20 golpes.
   NOTA: Se podrían utilizar otros métodos de homogeneización, por ejemplo, pasar la muestra a través de una jeringa. La eficiencia de homogeneización podría revelarse observando el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase.
10. Transfiera el homogeneizado a un tubo de centrifugación de 2 ml.
    NOTA: Cosechar 50 μL de homogeneizado con 12,5 μL de tampón de muestra 5x y etiquetarlo como lisado total.
11. Añadir 0,7 ml de HB al homogeneizado.
12. Girar el homogeneizado diluido a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: El pellet contiene núcleos y células ininterrumpidas.
13. Recoja 1,5 ml del sobrenadante y repita el paso 2,12 una vez.
14. Recolectar 1,4 ml del sobrenadante y etiquetarlo como sobrenadante postnuclear (SNP).

3. Preparación de la columna de gradiente de densidad

1. Transfiera 1,2 ml de SNP a un tubo de ultracentrífuga.
2. Añadir 1 ml de solución de sacarosa al 62% (2.351 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7,4) a la muestra y mezclar bien mediante pipeteo suave.
   NOTA: La solución resultante es una solución de sacarosa al 40,6%.
3. Agregue 3.3 ml de solución de sacarosa al 35% (1.177 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente en la parte superior de la muestra.
4. Agregue 2.2 ml de solución de sacarosa al 25% (0.806 M de sacarosa, 3 mM de imidazol a pH 7.4) cuidadosamente sobre la solución de sacarosa al 35%.
   NOTA: El índice de refracción de las soluciones de sacarosa al 62%, 40.6%, 35% y 25% a temperatura ambiente es de 1.44, 1.40, 1.39 y 1.37, respectivamente. Los índices de refracción de las soluciones de sacarosa se pudieron comprobar con un refractómetro para garantizar la precisión y la consistencia del experimento.
5. Llene el tubo de ultracentrifugación con HB.
   NOTA: Almacene temporalmente la columna de gradiente de densidad preparada a 4 °C.

4. Fraccionamiento y recuperación de la fracción que contiene endosomas de reciclaje

1. Centrifugar la columna a 210.000 x g durante 3 h a 4 °C.
2. Recolecte 12 fracciones (1 ml cada una) cuidadosamente, comenzando desde la parte superior del gradiente.
   NOTA: Los endosomas de reciclaje deben encontrarse en la interfaz entre soluciones de sacarosa al 35% y al 25%. Las fracciones recogidas pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C.
3. Diluir todas las fracciones con 1 mL de tampón de dilución (3 mM de imidazol a pH 7.4, 1 mM EDTA).
4. Centrifugar la muestra diluida a 100.000 x g durante 1 h a 4 °C.
5. Aspire el sobrenadante y agregue 50 μL de 1x tampón de muestra para cosechar las fracciones.
6. Analizar el contenido de proteínas en las fracciones mediante western blotting.

Resultados

Después de fraccionar las células HEK293 no transfectadas por ultracentrifugación por gradiente de densidad, se recolectaron 12 fracciones a partir de la parte superior del gradiente. Las fracciones cosechadas se diluyeron con el tampón de dilución en una proporción de 1:1 y se sometieron a una segunda ronda de centrifugación. Las muestras se sometieron a western blotting para analizar su contenido de proteínas. Como se muestra en la Figura 1,el marcador de endosoma de reciclaje Rab1...

Discusión

El protocolo anterior describe los procedimientos para aislar el reciclaje de endosomas de células cultivadas por ultracentrifugación. La fiabilidad de este método ha sido demostrada por la última publicación^22,demostrando que el reciclaje de endosomas se aísla con éxito de otros orgánulos(Figura 1),como el aparato de Golgi y las mitocondrias. Se debe prestar atención a algunos pasos críticos para obtener un buen resultado de separación. Al preparar las sol...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm tissue culture dish	SPL	20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Sample Buffer	GenScript	MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4850S	Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose	HyClone	SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 antibody (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade	HyClone	SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)	Ambion	AM4300	Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software	Bio-Rad		Measurement of band intensity
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody	Sigma	G6160	Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb	Cell Signaling Technology	2276S	Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche	4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody	Proteintech	20229-1-AP	Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062