Ultracentrifugation à gradient de densité pour l’étude du recyclage endocytaire dans les cellules de mammifères

Résumé

Cet article vise à présenter un protocole de préparation d’endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose.

Résumé

Le trafic endosomal est un processus cellulaire essentiel qui régule un large éventail d’événements biologiques. Les protéines sont internalisées à partir de la membrane plasmique, puis transportées vers les premiers endosomes. Les protéines internalisées pourraient être transitées vers le lysosome pour être dégradées ou recyclées vers la membrane plasmique. Une voie de recyclage endocytaire robuste est nécessaire pour équilibrer l’élimination des matériaux membranaires de l’endocytose. Diverses protéines régulent la voie, y compris le facteur ADP-ribosylation 6 (ARF6). L’ultracentrifugation par gradient de densité est une méthode classique de fractionnement cellulaire. Après la centrifugation, les organites sont sédimentés à leur surface isopycnique. Les fractions sont collectées et utilisées pour d’autres applications en aval. Décrit ici est un protocole pour obtenir une fraction contenant des endosomes de recyclage à partir de cellules de mammifères transfectées en utilisant l’ultracentrifugation par gradient de densité. Les fractions isolées ont été soumises à un transfert Western standard pour analyser leur teneur en protéines. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que le ciblage de la membrane plasmique de l’engloutissement et de la motilité cellulaire 1 (ELMO1), un facteur d’échange de nucléotides de guanine substrat 1 de la toxine botulique C3 (Rac1) lié à Ras, se fait par recyclage endocytaire médié par ARF6.

Introduction

Le trafic endosomal est un processus physiologique essentiel qui implique divers événements biologiques^1,par exemple, le transport des récepteurs de signalisation, des canaux ioniques et des molécules d’adhésion. Les protéines localisées au niveau de la membrane plasmique sont internalisées par endocytose^2. Les protéines internalisées sont ensuite triées par l’endosome^{précoce 3.} Certaines des protéines sont ciblées sur les lysosomes pour la dégradation⁴. Cependant, une quantité importante de protéines est recyclée à la surface de la cellule par des processus de recyclage rapides et lents. Lors d’un recyclage rapide, les protéines quittent les premiers endosomes et retournent directement à la membrane plasmique. Inversement, en cas de recyclage lent, les protéines sont d’abord triées dans le compartiment de recyclage endocytaire, puis transportées vers la membrane plasmique. Diverses protéines de cargaison, par exemple la clathrine, le complexe rétromère, le complexe retriever et la protéine du syndrome de Wiskott-Aldrich, et le complexe SCAR Homologue (WASH), participent à de tels processus de recyclage membranaire^4,5,6,7,8,9. L’équilibre de l’endocytose et de l’événement de recyclage est crucial pour la survie cellulaire et contribue à divers événements cellulaires¹⁰, par exemple, l’adhésion cellulaire, la migration cellulaire, la polarité cellulaire et la transduction du signal.

ARF6, une petite GTPase, est un régulateur signalé du trafic endocytaire^7,11,12. Fait intéressant, divers groupes de recherche ont illustré l’importance de l’ARF6 dans le recyclage endocytaire^{13,14,15,16,17}. L’étude vise à étudier la relation entre l’excroissance de neurites médiée par ARF6 et le recyclage endocytaire. Le rapport précédent suggère que l’activation d’ARF6 se fait en amont de l’activité rac1 en agissant sur ELMO1-dédicace du complexe de cytocinèse 1 (DOCK180)^18. Cependant, la façon dont ARF6 déclenche la signalisation Rac1 médiée par ELMO1-DOCK180 reste incertaine. L’ultracentrifugation par gradient de densité a été utilisée pour étudier le rôle du recyclage endocytaire médié par ARF6 dans un tel processus. En utilisant cela, la fraction contenant des endosomes de recyclage a été obtenue à partir de lysats cellulaires¹⁹. La fraction a été soumise à un transfert western pour l’analyse de la teneur en protéines. Les résultats de l’immunoblot ont révélé que sous la présence de FE65, une protéine adaptatrice enrichie en cerveau, l’ARF6 actif augmentait considérablement le niveau d’ELMO1 dans la fraction contenant des endosomes de recyclage. Le protocole suivant comprend les procédures pour (1) transfecter les cellules de mammifères; 2° la préparation des échantillons et des colonnes de gradient de densité; et (3) l’obtention de la fraction contenant des endosomes de recyclage.

Protocole

1. Culture et transfection de cellules de mammifères

1. Plaque 2 x 10⁶ cellules dans un plat de culture de 100 mm. Utilisez quatre plats pour chaque transfection.
   REMARQUE : Le nombre de cellules requises peut varier selon les lignées cellulaires. L’optimisation peut être nécessaire avant de passer à l’étape d’isolement.
2. Le lendemain, transfectez les cellules avec de la lipofectamine selon les instructions du fabricant.

2. Récolte cellulaire

1. Jeter le milieu de culture 48 h après la transfection.
2. Lavez les cellules avec du PBS glacé (phosphates de sodium de 10 mM, chlorure de potassium de 2,68 mM, chlorure de sodium de 140 mM) deux fois.
3. Ajouter 1 mL de^PBS+ glacé (PBS complété par un cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,5x et un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 0,5x) à chaque plat.
4. Recueillir les cellules avec un grattoir à cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
5. Abattez les cellules par centrifugation à l’aide d’un rotor à godet oscillant à 400 x g pendant 5 min.
6. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement la pastille cellulaire dans 5 mL de tampon d’homogénéisation (HB; 250 mM de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA complété par 0,03 mM de cycloheximide, 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1x cocktail d’inhibiteurs de phosphatase).
7. Prélever les cellules par centrifugation à 1 300 x g pendant 10 min.
8. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de HB.
9. Homogénéiser les cellules avec un homogénéisateur Dounce pendant 15 à 20 coups.
   REMARQUE: D’autres méthodes d’homogénéisation, par exemple, le passage de l’échantillon à travers une seringue, pourraient être utilisées. L’efficacité de l’homogénéisation pourrait être révélée en observant l’homogénat sous un microscope à contraste de phase.
10. Transférer l’homogénat dans un tube de centrifugation de 2 mL.
    REMARQUE: Récoltez 50 μL d’homogénat avec 12,5 μL de tampon d’échantillon 5x et étiquetez-le comme lysat total.
11. Ajouter 0,7 mL de HB à l’homogénat.
12. Faire tourner l’homogénat dilué à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE: La pastille contient des noyaux et des cellules ininterrompues.
13. Recueillir 1,5 mL du surnageant et répéter l’étape 2,12 une fois.
14. Recueillir 1,4 mL du surnageant et l’étiqueter comme surnageant post-nucléaire (SNP).

3. Préparation de la colonne de gradient de densité

1. Transférer 1,2 mL de PNS dans un tube ultracentrifuge.
2. Ajouter 1 mL de solution de saccharose à 62 % (2,351 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) à l’échantillon et bien mélanger par pipetage doux.
   REMARQUE: La solution résultante est une solution de saccharose à 40,6%.
3. Ajouter soigneusement 3,3 mL de solution de saccharose à 35 % (1,177 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur l’échantillon.
4. Ajouter soigneusement 2,2 mL de solution de saccharose à 25 % (0,806 M de saccharose, 3 mM d’imidazole à pH 7,4) sur la solution de saccharose à 35 %.
   NOTE: L’indice de réfraction des solutions de saccharose à 62%, 40,6%, 35% et 25% à température ambiante est de 1,44, 1,40, 1,39 et 1,37, respectivement. Les indices de réfraction des solutions de saccharose pourraient être vérifiés à l’aide d’un réfractomètre pour assurer la précision et la cohérence de l’expérience.
5. Remplissez le tube d’ultracentrifugation avec HB.
   REMARQUE : Stocker temporairement la colonne de gradient de densité préparée à 4 °C.

4. Fractionnement et récupération de la fraction contenant des endosomes recyclés

1. Centrifuger la colonne à 210 000 x g pendant 3 h à 4 °C.
2. Collectez 12 fractions (1 mL chacune) avec soin, en commençant par le haut du gradient.
   REMARQUE: Les endosomes de recyclage doivent être trouvés à l’interface entre 35% et 25% de solutions de saccharose. Les fractions collectées peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C.
3. Diluer toutes les fractions avec 1 mL de tampon de dilution (3 mM d’imidazole à pH 7,4, 1 mM d’EDTA).
4. Centrifuger l’échantillon dilué à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
5. Aspirer le surnageant et ajouter 50 μL de tampon d’échantillon 1x pour récolter les fractions.
6. Analyser la teneur en protéines dans les fractions par western blotting.

Résultats

Après avoir fractionné les cellules HEK293 non transfectées par ultracentrifugation du gradient de densité, 12 fractions ont été collectées à partir du haut du gradient. Les fractions récoltées ont été diluées avec le tampon de dilution dans un rapport de 1:1 et soumises à une deuxième série de centrifugation. Les échantillons ont ensuite été soumis à un transfert Western pour analyser leur teneur en protéines. Comme le montre la figure 1,le marqueur d’endosomes de rec...

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit les procédures d’isolement des endosomes de recyclage des cellules cultivées par ultracentrifugation. La fiabilité de cette méthode a été démontrée par la dernière publication²², prouvant que les endosomes de recyclage sont isolés avec succès d’autres organites(Figure 1),tels que l’appareil de Golgi et les mitochondries. Certaines étapes critiques doivent être prises en compte pour obtenir un bon résultat de séparati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm tissue culture dish	SPL	20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Sample Buffer	GenScript	MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4850S	Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose	HyClone	SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 antibody (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade	HyClone	SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)	Ambion	AM4300	Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software	Bio-Rad		Measurement of band intensity
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody	Sigma	G6160	Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb	Cell Signaling Technology	2276S	Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche	4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody	Proteintech	20229-1-AP	Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062