JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью данной статьи является представление протокола подготовки рециркулирующих эндосом из клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы.

Аннотация

Эндосомальный трафик является важным клеточным процессом, который регулирует широкий спектр биологических событий. Белки интернализуются из плазматической мембраны, а затем транспортируются в ранние эндосомы. Интернализованные белки могут быть переданы в лизосому для деградации или переработаны обратно в плазматическую мембрану. Надежный эндоцитарный путь рециркуляции необходим для балансировки удаления мембранных материалов от эндоцитоза. Сообщается, что различные белки регулируют этот путь, включая фактор АДФ-рибозилирования 6 (ARF6). Ультрацентрифугирование градиента плотности является классическим методом фракционирования клеток. После центрифугирования органеллы оседают на их изопикновой поверхности. Фракции собираются и используются для других последующих применений. Здесь описан протокол получения рециркулирующей эндосомной фракции из трансфектированных клеток млекопитающих с использованием ультрацентрифугирования градиента плотности. Выделенные фракции подвергали стандартному вестерн-блоттингу для анализа их белкового содержания. Используя этот метод, мы определили, что плазматическая мембрана, нацеленная на поглощение и подвижность клеток 1 (ELMO1), связанный с Ras субстрат ботулинического токсина C3 1 (Rac1) фактор обмена гуанина нуклеотида, осуществляется через ARF6-опосредованную эндоцитарную рециркуляцию.

Введение

Эндосомальный трафик является важным физиологическим процессом, который включает в себя различные биологические события1,например, транспортировку сигнальных рецепторов, ионных каналов и молекул адгезии. Белки, локализованные на плазматической мембране, интернализуются эндоцитозом2. Интернализованные белки затем сортируются ранней эндосомой3. Некоторые из белков нацелены на лизосомы для деградации4. Тем не менее, значительное количество белков перерабатывается обратно на поверхность клетки путем быстрой переработки и медленных процессов переработки. При быстрой рециркуляции белки покидают ранние эндосомы и непосредственно возвращаются в плазматическую мембрану. И наоборот, при медленной рециркуляции белки сначала сортируются в эндоцитарный рециркуляционный отсек, а затем транспортируются обратно в плазматическую мембрану. Различные грузовые белки, например, клатрин, ретромерный комплекс, комплекс ретривера и белок синдрома Вискотта-Олдрича, а также комплекс SCAR Homologue (WASH), участвуют в таких процессах рециркуляции мембран4,5,6,7,8,9. Баланс эндоцитоза и события рециркуляции имеет решающее значение для выживания клеток и способствует различным клеточным событиям10,например, клеточной адгезии, миграции клеток, полярности клеток и трансдукции сигнала.

ARF6, небольшая ГТФаза, является зарегистрированным регулятором эндоцитарного оборота7,11,12. Различные исследовательские группы проиллюстрировали важность ARF6 в эндоцитарной рециркуляции13,14,15,16,17. Исследование направлено на изучение взаимосвязи между ARF6-опосредованным ростом нейритов и эндоцитарной рециркуляцией. В предыдущем отчете предполагается, что активация ARF6 происходит вверх по течению до активности Rac1 через действие на ELMO1-дедикатор комплекса цитокинеза 1 (DOCK180)18. Однако остается неясным, как ARF6 запускает опосредованную сигнализацию Rac1 ELMO1-DOCK180. Ультрацентрифугирование градиента плотности было использовано для исследования роли эндоцитарной рециркуляции, опосредованной ARF6, в таком процессе. Используя это, рециркулирующая эндосомсодержащая фракция была получена из клеточных лизатов19. Фракцию подвергали вестерн-блоттингу для анализа содержания белка. Результаты иммуноблота показали, что в присутствии FE65, обогащенного мозгом адапторного белка, активный ARF6 существенно повышал уровень ELMO1 в рециркулирующей эндосомной фракции. Следующий протокол включает процедуры для (1) трансфекции клеток млекопитающих; 2) подготовка образцов и колонок градиента плотности; и 3) получение рециркулирующей эндосомосодержащей фракции.

протокол

1. Культура и трансфекция клеток млекопитающих

  1. Пластина 2 х 106 клеток в 100 мм культуральной посуде. Используйте по четыре блюда для каждой трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых ячеек может варьироваться для разных клеточных линий. Оптимизация может потребоваться, прежде чем перейти к этапу изоляции.
  2. На следующий день трансфектируют клетки липофектамином согласно инструкции производителя.

2. Сбор клеток

  1. Выбрасывают культуральную среду через 48 ч после трансфекции.
  2. Дважды промыть ячейки ледяным PBS (10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мМ калия хлорида, 140 мМ хлорида натрия).
  3. Добавьте 1 мл ледяного PBS+ (PBS, дополненный коктейлем ингибитора протеазы 0,5x и коктейлем ингибитора фосфатазы 0,5x).
  4. Соберите ячейки с помощью клеточного скребка и перенесите клеточную суспензию в центрифужную трубку объемом 15 мл.
  5. Гранулируйте ячейки центрифугированием с помощью поворотного ротора ковша при 400 х г в течение 5 мин.
  6. Откажитесь от супернатанта и осторожно повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера гомогенизации (HB; 250 мМ сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4, 1 мМ ЭДТА с добавлением циклогексимида 0,03 мМ, коктейля ингибитора протеазы и 1 коктейля ингибитора фосфатазы).
  7. Соберите клетки путем центрифугирования при 1 300 х г в течение 10 мин.
  8. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл ГВ.
  9. Гомогенизируйте клетки гомогенизатором Dounce в течение 15-20 ударов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие методы гомогенизации, например, пропускание образца через шприц. Эффективность гомогенизации может быть выявлена путем наблюдения гомогената под фазово-контрастным микроскопом.
  10. Перенесите гомогенат в центрифугированную трубку объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 50 мкл гомогената с 12,5 мкл 5-кратного буфера образца и пометьте его как общий лизат.
  11. Добавьте 0,7 мл HB к гомогенату.
  12. Раскрутите разбавленный гомогенат при 2 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула содержит ядра и неповрежденные клетки.
  13. Соберите 1,5 мл супернатанта и повторите шаг 2,12 один раз.
  14. Соберите 1,4 мл супернатанта и пометьте его как постядерный супернатант (PNS).

3. Подготовка колонны градиента плотности

  1. Переведите 1,2 мл ПНС в ультрацентрифужную трубку.
  2. Добавьте к образцу 1 мл 62% раствора сахарозы (2,351 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) и хорошо перемешайте путем бережного пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный раствор представляет собой 40,6% раствор сахарозы.
  3. Добавьте 3,3 мл 35% раствора сахарозы (1,177 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) осторожно поверх образца.
  4. Добавьте 2,2 мл 25% раствора сахарозы (0,806 М сахарозы, 3 мМ имидазола при рН 7,4) осторожно поверх 35% раствора сахарозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Показатель преломления 62%, 40,6%, 35% и 25% растворов сахарозы при комнатной температуре составляет 1,44, 1,40, 1,39 и 1,37 соответственно. Показатели преломления растворов сахарозы могут быть проверены с помощью рефрактометра для обеспечения точности и последовательности эксперимента.
  5. Заполните ультрацентрифугированную трубку HB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временно хранить подготовленную колонку градиента плотности при 4 °C.

4. Фракционирование и рекуперация рециркуляционной эндосомосодержащей фракции

  1. Центрифугировать колонну при 210 000 х г в течение 3 ч при 4 °C.
  2. Тщательно соберите 12 фракций (по 1 мл каждая), начиная с вершины градиента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рециркулирующие эндосомы должны находиться на границе между 35% и 25% растворами сахарозы. Собранные фракции могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 °C.
  3. Разбавить все фракции 1 мл буфера разбавления (3 мМ имидазола при рН 7,4, 1 мМ ЭДТА).
  4. Центрифугировать разбавленный образец при 100 000 х г в течение 1 ч при 4°С.
  5. Аспирируйте супернатант и добавьте 50 мкл 1x буфера образца для сбора фракций.
  6. Проанализируйте содержание белка во фракциях методом вестерн-блоттинга.

Результаты

После фракционирования нетрансфектированных клеток HEK293 ультрацентрифугированием градиента плотности собирали 12 фракций, начиная с вершины градиента. Собранные фракции разбавляли буфером разбавления в соотношении 1:1 и подвергали второму раунду центрифугирования. Затем образцы были...

Обсуждение

В приведенном выше протоколе описываются процедуры выделения эндосом рециркуляции из культивируемых клеток путем ультрацентрифугирования. Надежность этого метода была продемонстрирована последней публикацией22,доказывающей, что рециркулирующие эндосомы успешно выдел...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана средствами Совета по исследовательским грантам Гонконга, схемы прямых грантов CUHK, эндаумент-фонда United College и благотворительного фонда TUYF. Цифры в этой работе были адаптированы из нашей предыдущей публикации «ARF6-Rac1 сигнально-опосредованный рост нейритов потенцируется нейронным адаптером FE65 посредством оркестровки ARF6 и ELMO1», опубликованной в журнале FASEB в октябре 2020 года.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm tissue culture dishSPL20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Sample BufferGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAbCell Signaling Technology4850SRabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucoseHyCloneSH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 antibody (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research GradeHyCloneSV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)AmbionAM4300Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMeasurement of band intensity
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibodySigmaG6160Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAbCell Signaling Technology2276SMouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, DihydrateCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Reduced Serum MediaGibco31985070
PBS TabletsGibco18912014
PhosSTOPRoche4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibodyProteintech20229-1-APRabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300062

Ссылки

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172ARF6Rab11

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены