Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Dieser Beitrag zielt darauf ab, ein Protokoll zur Herstellung von Recycling-Endosomen aus Säugetierzellen unter Verwendung der Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugation vorzustellen.

Zusammenfassung

Der endosomale Transport ist ein essentieller zellulärer Prozess, der eine breite Palette biologischer Ereignisse reguliert. Proteine werden aus der Plasmamembran internalisiert und dann zu den frühen Endosomen transportiert. Die internalisierten Proteine könnten zum Abbau in das Lysosom überführt oder zur Plasmamembran zurückgeführt werden. Ein robuster endozytärer Recyclingweg ist erforderlich, um die Entfernung von Membranmaterialien aus der Endozytose auszugleichen. Es wird berichtet, dass verschiedene Proteine den Signalweg regulieren, einschließlich ADP-Ribosylierungsfaktor 6 (ARF6). Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation ist eine klassische Methode zur Zellfraktionierung. Nach der Zentrifugation werden Organellen an ihrer isopyknen Oberfläche sedimentiert. Die Fraktionen werden gesammelt und für andere nachgelagerte Anwendungen verwendet. Hier beschrieben ist ein Protokoll zur Gewinnung einer Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion aus transfizierten Säugetierzellen mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die isolierten Fraktionen wurden zur Analyse ihres Proteingehalts einem Standard-Western-Blotting unterzogen. Durch die Anwendung dieser Methode identifizierten wir, dass die Plasmamembran, die auf Engulfment und Zellmotilität 1 (ELMO1), einen Ras-verwandten C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1) Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, abzielt, durch ARF6-vermitteltes endozytäres Recycling erfolgt.

Einleitung

Der endosomale Transport ist ein essentieller physiologischer Prozess, der verschiedene biologische Ereignisse¹impliziert, z. B. den Transport von Signalrezeptoren, Ionenkanälen und Adhäsionsmolekülen. Proteine, die an der Plasmamembran lokalisiert sind, werden durch Endozytose^{internalisiert 2}. Die internalisierten Proteine werden dann nach dem frühen Endosom³sortiert. Einige der Proteine zielen auf Lysosomen zum Abbau ab⁴. Eine beträchtliche Menge an Proteinen wird jedoch durch schnelles Recycling und langsame Recyclingprozesse wieder auf die Zelloberfläche zurückgeführt. Beim schnellen Recycling verlassen Proteine die frühen Endosomen und kehren direkt zur Plasmamembran zurück. Umgekehrt werden beim langsamen Recycling Proteine zunächst in das endozytäre Recyclingkompartiment sortiert und dann zurück zur Plasmamembran transportiert. Verschiedene Frachtproteine, zum Beispiel Clathrin, Retromerkomplex, Retrieverkomplex und Wiskott-Aldrich-Syndrom-Protein sowie SCAR Homologue (WASH) -Komplex, nehmen an solchen Membranrecyclingprozessen^{teil 4,5,6,7,8,9}. Das Gleichgewicht der Endozytose und des Recyclingereignisses ist entscheidend für das Überleben der Zelle und trägt zu verschiedenen zellulären Ereignissen¹⁰bei, z. B. Zelladhäsion, Zellmigration, Zellpolarität und Signaltransduktion.

ARF6, eine kleine GTPase, ist ein berichteter Regulator des endozytären Transports^7,11,12. Interessant ist, dass verschiedene Forschungsgruppen die Bedeutung von ARF6 für das endozytäre Recycling^13,14,15,16,^17aufgezeigthaben. Die Studie zielt darauf ab, den Zusammenhang zwischen ARF6-vermitteltem Neuritenauswuchs und endozytärem Recycling zu untersuchen. Der vorherige Bericht legt nahe, dass die Aktivierung von ARF6 der Rac1-Aktivität vorgelagert ist, indem sie auf den ELMO1-Dedikator des Zytokinese-1-Komplexes (DOCK180)¹⁸einwirkt. Wie ARF6 jedoch die ELMO1-DOCK180-vermittelte Rac1-Signalisierung auslöst, bleibt unklar. Die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eingesetzt, um die Rolle des ARF6-vermittelten endozytären Recyclings in einem solchen Prozess zu untersuchen. Auf diese Weise wurde die Recycling-Endosomen-haltige Fraktion aus Zelllysaten¹⁹erhalten. Die Fraktion wurde für die Proteingehaltsanalyse einem Western Blotting unterzogen. Die Immunoblot-Ergebnisse zeigten, dass unter Der Anwesenheit von FE65, einem mit dem Gehirn angereicherten Adapterprotein, aktives ARF6 den Gehalt an ELMO1 in der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion erheblich erhöhte. Das folgende Protokoll enthält die Verfahren für (1) die Transfektionierung von Säugetierzellen; (2) Vorbereitung der Proben und Dichtegradientensäulen; und (3) Gewinnung der Recycling-Endosomen-haltigen Fraktion.

Protokoll

1. Zellkultur und Transfektion von Säugetieren

1. Platte 2 x 10⁶ Zellen in einer 100 mm Kulturschale. Verwenden Sie vier Gerichte für jede Transfektion.
   HINWEIS: Die Anzahl der benötigten Zellen kann für verschiedene Zelllinien variieren. Möglicherweise ist eine Optimierung erforderlich, bevor Sie mit dem Isolationsschritt fortfahren.
2. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2. Zellernte

1. Entsorgen Sie das Kulturmedium 48 h nach der Transfektion.
2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS (10 mM Natriumphosphate, 2,68 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid).
3. Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS⁺ (PBS ergänzt mit 0,5x Protease-Inhibitor-Cocktail und 0,5x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail) zu jedem Gericht hinzu.
4. Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation mit einem Schwenklöffelrotor bei 400 x g für 5 min.
6. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 5 ml Homogenisierungspuffer (HB; 250 mM Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA ergänzt mit 0,03 mM Cycloheximid, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail und 1x Phosphatase-Inhibitor-Cocktail).
7. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.300 x g für 10 min.
8. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml HB.
9. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem Dounce-Homogenisator für 15-20 Hübe.
   ANMERKUNG: Andere Homogenisierungsmethoden, z. B. das Durchlaufen der Probe durch eine Spritze, könnten verwendet werden. Die Homogenisierungseffizienz konnte durch die Beobachtung des Homogenats unter einem Phasenkontrastmikroskop aufgedeckt werden.
10. Das Homogenat wird in ein 2 ml Zentrifugationsröhrchen überführt.
    HINWEIS: Ernten Sie 50 μL Homogenat mit 12,5 μL 5x Probenpuffer und markieren Sie es als Gesamtlysat.
11. Dem Homogenat werden 0,7 ml HB zugegeben.
12. Das verdünnte Homogenat bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C drehen.
    HINWEIS: Das Pellet enthält Kerne und ungebrochene Zellen.
13. Sammeln Sie 1,5 ml des Überstandes und wiederholen Sie Schritt 2.12 einmal.
14. Sammeln Sie 1,4 ml des Überstandes und kennzeichnen Sie ihn als postnuklearen Überstand (PNS).

3. Vorbereitung der Dichtegradientensäule

1. Übertragen Sie 1,2 ml PNS in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
2. 1 mL 62%ige Saccharoselösung (2,351 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) in die Probe geben und durch schonendes Pipettieren gut mischen.
   HINWEIS: Die resultierende Lösung ist eine 40,6% ige Saccharoselösung.
3. 3,3 ml 35%ige Saccharoselösung (1,177 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die Probe geben.
4. 2,2 ml 25%ige Saccharoselösung (0,806 M Saccharose, 3 mM Imidazol bei pH 7,4) vorsichtig auf die 35%ige Saccharoselösung geben.
   ANMERKUNG: Der Brechungsindex der 62%, 40,6%, 35% und 25% Saccharoselösungen bei Raumtemperatur beträgt 1,44, 1,40, 1,39 bzw. 1,37. Die Brechungsindizes der Saccharoselösungen konnten mit einem Refraktometer überprüft werden, um die Präzision und Konsistenz des Experiments sicherzustellen.
5. Füllen Sie das Ultrazentrifugationsrohr mit HB auf.
   HINWEIS: Die vorbereitete Dichtegradientensäule wird bei 4 °C zwischengespeichert.

4. Fraktionierung und Rückgewinnung von Recycling-Endosomen-haltigen Fraktionen

1. Zentrifugieren Sie die Säule bei 210.000 x g für 3 h bei 4 °C.
2. Sammeln Sie 12 Fraktionen (je 1 ml) sorgfältig, beginnend von der Spitze des Gradienten.
   HINWEIS: Die Recycling-Endosomen sollten an der Grenzfläche zwischen 35% und 25% Saccharoselösungen gefunden werden. Die gesammelten Fraktionen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden.
3. Verdünnen Sie alle Fraktionen mit 1 ml Verdünnungspuffer (3 mM Imidazol bei pH 7,4, 1 mM EDTA).
4. Zentrifugieren Sie die verdünnte Probe bei 100.000 x g für 1 h bei 4 °C.
5. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 50 μL 1x Probenpuffer hinzu, um die Fraktionen zu ernten.
6. Analysieren Sie den Proteingehalt in den Fraktionen durch Western Blotting.

Ergebnisse

Nach der Fraktionierung der nicht transfizierten HEK293-Zellen durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurden 12 Brüche von der Spitze des Gradienten gesammelt. Die geernteten Fraktionen wurden mit dem Verdünnungspuffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und einer zweiten Zentrifugationsrunde unterzogen. Die Proben wurden dann einem Western Blotting unterzogen, um ihren Proteingehalt zu analysieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt,wird der Recycling-Endosomenmarker Rab11 in Fraktion 7

Diskussion

Das obige Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung von Recycling-Endosomen aus kultivierten Zellen durch Ultrazentrifugation. Die Zuverlässigkeit dieser Methode wurde durch die neueste Veröffentlichung²²nachgewiesen, die beweist, dass Recycling-Endosomen erfolgreich aus anderen Organellen (Abbildung 1) wie dem Golgi-Apparat und den Mitochondrien isoliert werden. Einige kritische Schritte müssen beachtet werden, um ein gutes Trennergebnis zu erzielen. Bei d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm tissue culture dish	SPL	20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Sample Buffer	GenScript	MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4850S	Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose	HyClone	SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 antibody (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade	HyClone	SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)	Ambion	AM4300	Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software	Bio-Rad		Measurement of band intensity
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody	Sigma	G6160	Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb	Cell Signaling Technology	2276S	Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche	4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody	Proteintech	20229-1-AP	Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062