JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.

Abstract

סחר אנדוסומלי הוא תהליך תאי חיוני המסדיר מגוון רחב של אירועים ביולוגיים. חלבונים מופנמים מקרום הפלזמה ולאחר מכן מועברים לאנדוזומים המוקדמים. החלבונים המופנמים יכולים להיות מועברים ליזוזום להשפלה או ממוחזר בחזרה לקרום הפלזמה. מסלול מיחזור אנדוציטי חזק נדרש כדי לאזן את הסרת חומרי הממברנה מאנדוציטוזיס. חלבונים שונים מדווחים כדי לווסת את המסלול, כולל גורם ADP-ריבוסילציה 6 (ARF6). אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות היא שיטה קלאסית לפירוק תאים. לאחר הצנטריפוגה, אברונים הם משקעים על פני השטח האיזופקניים שלהם. השברים נאספים ומשמשים עבור יישומים אחרים במורד הזרם. מתואר כאן פרוטוקול להשגת שבר המכיל אנדוזום ממחזור מתאי יונקים שהודבקו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. השברים המבודדים היו נתונים לכתמים מערביים סטנדרטיים לניתוח תכולת החלבון שלהם. על ידי שימוש בשיטה זו, זיהינו כי מיקוד קרום הפלזמה של בלוע תנועתיות תא 1 (ELMO1), מצע רעלן בוטולינום C3 הקשורים לראס 1 (Rac1) גורם החלפת נוקלאוטידים גואנין, הוא באמצעות מיחזור אנדוציטי בתיווך ARF6.

Introduction

סחר אנדוסומלי הוא תהליך פיזיולוגי חיוני המסבך אירועים ביולוגיים שונים1, למשל, הובלה של קולטני איתות, תעלות יונים ומולקולות הידבקות. חלבונים מקומיים בקרום הפלזמה מופנמים על ידי אנדוציטוזיס2. החלבונים המופנמים ממוינים לאחר מכן על ידי אנדוזום מוקדם3. חלק מהחלבונים מיועדים ליזוזומים להשפלה4. עם זאת, כמות משמעותית של חלבונים ממוחזרים בחזרה לפני השטח של התא על ידי מיחזור מהיר ותהליכי מיחזור איטיים. במיחזור מהיר, חלבונים לעזוב את אנדוזומים המוקדמים ולחזור ישירות קרום הפלזמה. לעומת זאת, במיחזור איטי, חלבונים ממוינים תחילה לתא המיחזור האנדיוציטי ולאחר מכן מועברים בחזרה לקרום הפלזמה. חלבוני מטען שונים, למשל, קלתרין, קומפלקס רטרומר, קומפלקס רטריבר וחלבון תסמונת ויסקוט-אולדריץ ', ותסביך SCAR Homologue (WASH), משתתפים בתהליכי מיחזור ממברנה כאלה4,5,6,7,8,9. האיזון של אירוע אנדוציטוזיס ומיחזור הוא חיוני להישרדות התא ותורם לאירועים תאיים שונים10, למשל, הידבקות תאים, נדידת תאים, קוטביות התא, טרנסדוקציה של אותות.

ARF6, GTPase קטן, הוא רגולטור דיווח של סחר אנדוציטי7,11,12. מעניין, קבוצות מחקר שונות המחישו את החשיבות של ARF6 במיחזור אנדוציטי13,14,15,16,17. מטרת המחקר היא לחקור את הקשר בין תולדת הנויריט בתיווך ARF6 לבין מיחזור אנדוציטי. הדו"ח הקודם מציע כי ההפעלה של ARF6 היא במעלה הזרם לפעילות Rac1 באמצעות פועל על ELMO1-dedicator של ציטוקינזיס 1 (DOCK180)קומפלקס 18. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד ARF6 מפעיל את איתות Rac1 המתווך של ELMO1-DOCK180. צפיפות הדרגתית אולטרה צנטריפוגה הועסק כדי לחקור את התפקיד של ARF6 בתיווך מיחזור אנדוציטי בתהליך כזה. באמצעות זה, השבר המכיל אנדוזום מיחזור הושג מ lysates התא19. השבר היה נתון לכתמים מערביים לניתוח תכולת חלבון. תוצאות החיסון חשפו כי תחת נוכחותו של FE65, חלבון מתאם מועשר במוח, ARF6 פעיל הגדיל באופן משמעותי את רמת ELMO1 בשבר המכיל אנדוזום מיחזור. הפרוטוקול הבא כולל את הנהלים ל(1) תאים יונקים; (2) הכנת הדגימות ועמודות מעבר צבע בצפיפות; ות (3) קבלת השבר המכיל אנדוזום למיחזור.

Protocol

1. תרבית תאים של יונקים וזיהוי

  1. צלחת 2 x 106 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. השתמש בארבע מנות עבור כל transfection.
    הערה: מספר התאים הנדרשים עשוי להשתנות עבור שורות תאים שונות. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה לפני שתמשיך לשלב הבידוד.
  2. למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן.

2. קציר תאים

  1. השלך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר טרנספקט.
  2. לשטוף את התאים עם PBS קר כקרח (10 mM נתרן פוספטים, 2.68 mM אשלגן כלורי, 140 mM נתרן כלורי) פעמיים.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח+ (PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5x וקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5x) לכל מנה.
  4. לאסוף את התאים עם מגרד תא ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה ב 400 x g במשך 5 דקות.
  6. השליכו את הסופרנט והדביקו מחדש את גלולה התא בעדינות ב-5 מ"ל של חוצץ הומוגניזציה (HB; 250 מ"מ סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב-pH 7.4, 1 mM EDTA בתוספת 0.03 מ"מ cycloheximide, קוקטייל מעכב פרוטאז 1x וקוקטייל מעכב פוספטאז 1x).
  7. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1,300 x g במשך 10 דקות.
  8. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של HB.
  9. הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce עבור 15-20 משיכות.
    הערה: שיטות הומוגניזציה אחרות, למשל, העברת המדגם דרך מזרק, ניתן להשתמש. יעילות ההומוגניזציה יכולה להתגלות על ידי התבוננות בהומוגנט תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
  10. מעבירים את ההומוגנית לצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל.
    הערה: קציר 50 μL של הומוגניאט עם 12.5 μL של 5x מאגר מדגם ולתייג אותו כמו ליסייט הכולל.
  11. הוסף 0.7 מ"ל של HB להומוגניט.
  12. סובב את ההומוגנאט מדולל ב 2,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: הכדור מכיל גרעינים ותאים רצוף.
  13. לאסוף 1.5 מ"ל של supernatant ולחזור על שלב 2.12 פעם אחת.
  14. לאסוף 1.4 מ"ל של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעין supernatant (PNS).

3. הכנת עמודות הדרגתיות בצפיפות

  1. העבר 1.2 מ"ל של PNS לצינור אולטרה צנטריפוגה.
  2. הוסיפו 1 מ"ל לתמיסת סוכרוז 62% (2.351 M סוכרוז, 3 מ"מ imidazole ב- pH 7.4) וערבבו היטב על ידי צנרת עדינה.
    הערה: הפתרון המתקבל הוא פתרון סוכרוז של 40.6%.
  3. הוסף 3.3 מ"ל של פתרון סוכרוז 35% (1.177 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי המדגם.
  4. הוסף 2.2 מ"ל של 25% תמיסה סוכרוז (0.806 M סוכרוז, 3 mM imidazole ב pH 7.4) בזהירות על גבי פתרון 35% סוכרוז.
    הערה: המדד השבירה של 62%, 40.6%, 35% ו-25% פתרונות סוכרוז בטמפרטורת החדר הם 1.44, 1.40, 1.39 ו-1.37, בהתאמה. ניתן לבדוק את האינדקסים השבירה של פתרונות הסורוז עם שבירה כדי להבטיח את הדיוק והעקביות של הניסוי.
  5. מלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה ב-HB.
    הערה: אחסן באופן זמני את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות המוכנה ב- 4 °C (70 °F).

4. שבר והתאוששות של שבר המכיל אנדוזום מיחזור

  1. צנטריפוגות את העמודה ב 210,000 x g עבור 3 שעות ב 4 °C (70 °F).
  2. אסוף 12 שברים (1 מ"ל כל אחד) בזהירות, החל מראש מעבר הצבע.
    הערה: יש למצוא את אנדוזומים המיחזור בממשק בין 35% ל -25% פתרונות סוכרוז. השברים שנאספו יכולים להיות קפואים בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל את כל השברים עם 1 מ"ל של חוצץ דילול (3 mM imidazole ב pH 7.4, 1 mM EDTA).
  4. צנטריפוגה מדגם מדולל ב 100,000 x גרם עבור 1 שעה ב 4 °C (70 °F).
  5. שאפו את supernatant ולהוסיף 50 μL של חוצץ מדגם 1x כדי לקצור את השברים.
  6. לנתח את תכולת החלבון בשברים על ידי סופג מערבי.

תוצאות

לאחר פירוק תאי HEK293 הלא נגועים על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, נאספו 12 שברים החל מראש מעבר הצבע. השברים שנקטפו דוללו עם מאגר הדילול ביחס של 1:1 ונחשפו לסיבוב שני של צנטריפוגה. הדגימות היו נתונות אז סופג מערבי לניתוח תכולת החלבון שלהם. כפי שמוצג באיור 1, סמן המיחזור ש?...

Discussion

הפרוטוקול לעיל מתאר את הנהלים לבידוד אנדוזומים של מיחזור תרבית על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. האמינות של שיטה זו הוכח על ידי הפרסום האחרון22, המוכיח כי מיחזור אנדוזומים מבודדים בהצלחה אברונים אחרים (איור 1), כגון מנגנון Golgi ומיטוכונדריה. יש לשים לב לכמה צעדים קריטיים ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם תוכן מאמר זה.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממועצת מענקי המחקר בהונג קונג, תוכנית המענקים הישירים של CUHK, קרן ההקדש של מכללת יונייטד וקרן הצדקה TUYF. הנתונים בעבודה זו הותאמו מהפרסום הקודם שלנו, "ARF6-Rac1 איתות-תיווך נורייט גדל הוא potentiated על ידי מתאם עצבי FE65 באמצעות תזמור ARF6 ו ELMO1" שפורסם בכתב העת FASEB באוקטובר 2020.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm tissue culture dishSPL20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Sample BufferGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAbCell Signaling Technology4850SRabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucoseHyCloneSH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 antibody (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research GradeHyCloneSV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)AmbionAM4300Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMeasurement of band intensity
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibodySigmaG6160Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAbCell Signaling Technology2276SMouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, DihydrateCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Reduced Serum MediaGibco31985070
PBS TabletsGibco18912014
PhosSTOPRoche4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibodyProteintech20229-1-APRabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300062

References

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172ARF6Rab11

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved