Ultracentrifugação de gradiente de densidade para investigar a reciclagem endócítica em células mamíferas

Resumo

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo para preparar endossóis de reciclagem de células mamíferas usando ultracentrifugação gradiente de densidade de sacarose.

Resumo

O tráfico endossomal é um processo celular essencial que regula uma ampla gama de eventos biológicos. As proteínas são internalizadas da membrana plasmática e depois transportadas para os endossómos iniciais. As proteínas internalizadas podem ser transitadas para o lysosome para degradação ou recicladas de volta à membrana plasmática. Uma via robusta de reciclagem endócítica é necessária para equilibrar a remoção de materiais de membrana da endocitose. Várias proteínas são relatadas para regular a via, incluindo o fator de ribossiation ADP 6 (ARF6). A ultracentrifugação gradiente de densidade é um método clássico para fracionamento celular. Após a centrifugação, organelas são sedimentadas em sua superfície isopécnica. As frações são coletadas e usadas para outras aplicações a jusante. Descrito aqui é um protocolo para obter uma fração contendo endosome de células de mamíferos transfectadas usando ultracentrifugação de gradiente de densidade. As frações isoladas foram submetidas à mancha ocidental padrão para analisar seu conteúdo proteico. Ao utilizar este método, identificamos que o direcionamento da membrana plasmática do engolfamento e da motilidade celular 1 (ELMO1), um substrato de toxina botulínica C3 relacionado a Ras 1 (Rac1) fator de troca de nucleotídeos de guanina, é através da reciclagem endocítica mediada por ARF6.

Introdução

O tráfico endossomal é um processo fisiológico essencial que implica vários eventos biológicos¹, por exemplo, o transporte de receptores de sinalização, canais de íons e moléculas de adesão. Proteínas localizadas na membrana plasmática são internalizadas por endocitose². As proteínas internalizadas são então classificadas pelo endosomma^{precoce 3}. Algumas das proteínas são direcionadas para lisesomos para degradação⁴. No entanto, uma quantidade significativa de proteínas são recicladas de volta à superfície celular por processos de reciclagem rápidos e lentas. Na reciclagem ....

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Protocolo

1. Cultura e transfecção de células mamíferas

1. Placa 2 x 10⁶ células em um prato de cultura de 100 mm. Use quatro pratos para cada transfecção.
   NOTA: O número de células necessárias pode variar para diferentes linhas celulares. A otimização pode ser necessária antes de prosseguir para a etapa de isolamento.
2. No dia seguinte, transfete as células com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante.

2. Colheita celular

1. Descarte o meio de cultura 48 h pós-transfecção.
2. Lave as células com PBS gelado (fosfatos de sódio de 10 mM, cloreto de potássio de 2,68 mM, cloreto de sódio de ....

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Resultados

Após fracionar as células HEK293 não traduzidas por ultracentrifugação gradiente de densidade, 12 frações foram coletadas a partir do topo do gradiente. As frações colhidas foram diluídas com o tampão de diluição em uma razão de 1:1 e submetidas a uma segunda rodada de centrifugação. As amostras foram então submetidas a manchas ocidentais para análise de seu conteúdo proteico. Como mostrado na Figura 1,o marcador de reciclagem endosome Rab11 é detectado na fração 7

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Discussão

O protocolo acima descreve os procedimentos para isolar a reciclagem de endossóis de células cultivadas por ultracentrifugação. A confiabilidade desse método foi demonstrada pela última^{publicação 22}, comprovando que os endosários de reciclagem são isolados com sucesso de outras organelas (Figura 1),como o aparelho golgi e mitocôndrias. Alguns passos críticos precisam ser atentos para obter um bom resultado de separação. Ao preparar as soluções de sacar.......

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm	Beckman Coulter	347287
100 mm tissue culture dish	SPL	20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	C14277
5x Sample Buffer	GenScript	MB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	4850S	Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mL	DWK Life Sciences	357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose	HyClone	SH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)	Santa Cruz Biotechnology	SC-271519	Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
FE65 antibody (E-20)	Santa Cruz Biotechnology	SC-19751	Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research Grade	HyClone	SV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)	Ambion	AM4300	Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab Software	Bio-Rad		Measurement of band intensity
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibody	Sigma	G6160	Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAb	Cell Signaling Technology	2276S	Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate	Calbiochem	4010-OP
Optima L-100 XP	Beckman Coulter	392050
Optima MAX-TL	Beckman Coulter	A95761
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Gibco	31985070
PBS Tablets	Gibco	18912014
PhosSTOP	Roche	4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibody	Proteintech	20229-1-AP	Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
Sucrose	Affymetrix	AAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062