JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول لإعداد الاندوسومات المعاد تدويرها من خلايا الثدييات باستخدام الطرد الفائق الانحدار لكثافة السكروز.

Abstract

20- الاتجار بالمخدرات بالنهر هو عملية خلوية أساسية تنظم طائفة واسعة من الأحداث البيولوجية. يتم استيعاب البروتينات من غشاء البلازما ثم يتم نقلها إلى الاندوسومات المبكرة. يمكن نقل البروتينات الداخلية إلى الليسوسوم للتحلل أو إعادة تدويرها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. مطلوب مسار إعادة تدوير الغدد الصماء قوية لتحقيق التوازن بين إزالة مواد الغشاء من الغدد الصماء. وتفيد التقارير أن البروتينات المختلفة لتنظيم المسار، بما في ذلك عامل الريبوسيليشن ADP-6 (ARF6). الكثافة الانحدار الطرد الفائق هو أسلوب كلاسيكي يجزئ الخلية. بعد الطرد المركزي، يتم ترسيب العضيات على سطحها غير المقوي. يتم تجميع الكسور واستخدامها لتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى. الموصوفة هنا بروتوكول للحصول على إعادة تدوير النعوم المحتوية على جزء من خلايا الثدييات المصابة باستخدام كثافة التدرج الطرد الفائق. تعرضت الكسور المعزولة للنشاف الغربي القياسي لتحليل محتويات البروتين الخاصة بها. من خلال استخدام هذه الطريقة ، حددنا أن غشاء البلازما الذي يستهدف الابتلاع وحركة الخلية 1 (ELMO1) ، وهو مادة توكسين C3 botulinum ذات الصلة من راس ركيزة 1 (Rac1) عامل تبادل نواة جوانين ، هو من خلال إعادة التدوير الانسطي بوساطة ARF6.

Introduction

الاتجار بالاندوسومال هو عملية فسيولوجية أساسية تورط مختلف الأحداث البيولوجية1، على سبيل المثال ، نقل مستقبلات الإشارات ، والقنوات الأيونية ، وجزيئات الالتصاق. يتم استيعاب البروتينات المترجمة في غشاء البلازما عن طريق الغدد الصماء2. ثم يتم فرز البروتينات الداخلية من قبل endosome3في وقت مبكر . وتستهدف بعض البروتينات إلى الليسوسومات لتدهور4. ومع ذلك، يتم إعادة تدوير كمية كبيرة من البروتينات مرة أخرى إلى سطح الخلية عن طريق إعادة التدوير السريع وعمليات إعادة التدوير البطيئة. في إعادة التدوير السريع ، تترك البروتينات الاندوسومات المبكرة وتعود مباشرة إلى غشاء البلازما. وعلى العكس من ذلك، في إعادة التدوير البطيئة، يتم فرز البروتينات أولا إلى مقصورة إعادة التدوير الصماء ثم يتم نقلها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. بروتينات الشحن المختلفة، على سبيل المثال، clathrin، مجمع ريتريمر، مجمع المسترد وبروتين متلازمة ويسكوت الدريتش، ومجمع SCAR Homologue (WASH)، تشارك في عملياتإعادة تدوير الأغشية هذه4و5و6و7و8و9. توازن حدث الانسد وإعادة التدوير أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلية ويساهم في الأحداث الخلوية المختلفة10، على سبيل المثال ، التصاق الخلايا ، وهجرة الخلايا ، قطبية الخلية ، ونقل الإشارات.

ARF6، GTPase صغيرة، هو منظم ذكرت من الاتجار بالغدد الصماء7،11،12. من المثير للاهتمام، وقد أوضحت مجموعات بحثية مختلفة أهمية ARF6 في إعادة التدوير13،14،15،16،17. وتهدف الدراسة إلى التحقيق في العلاقة بين نمو العصب بوساطة ARF6 وإعادة التدوير الانسطي. يشير التقرير السابق إلى أن تفعيل ARF6 هو المنبع إلى نشاط Rac1 من خلال العمل على ELMO1-dedicator من السيتوكينسيس 1 (DOCK180) مجمع18. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف يؤدي ARF6 إلى إشارة RAC1 بوساطة ELMO1-DOCK180. واستخدمت أجهزة الطرد الفائق الانحدار للكثافة للتحقيق في دور إعادة التدوير الإندوسيتيكي بوساطة ARF6 في هذه العملية. باستخدام ذلك ، تم الحصول على إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإنسوم من lysatesالخلية 19. تعرض الكسر للنشاف الغربي لتحليل محتوى البروتين. كشفت نتائج المؤامرة المناعية أنه في ظل وجود FE65 ، وهو بروتين محول غني بالدماغ ، زاد ARF6 النشط بشكل كبير من مستوى ELMO1 في الكسر المحتوي على الإنسوم المعاد تدويره. ويتضمن البروتوكول التالي إجراءات (1) خلايا الثدييات العابرة؛ (2) الإصابة بالخلايا الثديية؛ (2) الإصابة بخلايا الثدييات؛ (2) الإصابة بخلايا الثدييات؛ (2) الإصابة بخلايا ال (2) إعداد العينات وأعمدة تدرج الكثافة؛ و (3) الحصول على إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإندوسوم.

Protocol

1. زراعة خلايا الثدييات والعابها

  1. طبق 2 × 106 خلايا في طبق ثقافة 100 ملم. استخدم أربعة أطباق لكل إصابة.
    ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المطلوبة لخطوط الخلايا المختلفة. قد يكون التحسين ضروريا قبل الانتقال إلى خطوة العزل.
  2. في اليوم التالي، تحمى الخلايا مع ليبوفيكتامين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. حصاد الخلية

  1. تجاهل الثقافة المتوسطة 48 ساعة بعد العدوى.
  2. غسل الخلايا مع الجليد الباردة PBS (10 mM فوسفات الصوديوم، 2.68 mM كلوريد البوتاسيوم، 140 mM كلوريد الصوديوم) مرتين.
  3. إضافة 1 مل من الجليد الباردة PBS+ (برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5x كوكتيل مثبطات البروتيز و0.5x كوكتيل مثبط فوسفاتاز) إلى كل طبق.
  4. جمع الخلايا مع مكشطة الخلية ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  5. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام الدوار دلو سوينغ في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية بلطف في 5 مل من العازلة التجانس (HB; 250 mM السكروز, 3 mM imidazole في درجة الحموضة 7.4, 1 MM EDTA تكملها مع 0.03 mM سيكلوهيكسميد, 1x كوكتيل البروتيز, و1x كوكتيل مثبط فوسفاتاز).
  7. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1300 × ز لمدة 10 دقيقة.
  8. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من HB.
  9. تجانس الخلايا مع المتجانس Dounce ل15-20 السكتات الدماغية.
    ملاحظة: يمكن استخدام طرق التجانس الأخرى، على سبيل المثال، تمرير العينة من خلال حقنة. ويمكن الكشف عن كفاءة التجانس من خلال مراقبة التجانس تحت مجهر التباين المرحلي.
  10. نقل المتجانسة إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
    ملاحظة: حصاد 50 ميكرولتر من المتجانسة مع 12.5 ميكرولتر من 5x عينة المخزن المؤقت وتسميته كما lysate الكلي.
  11. إضافة 0.7 مل من HB إلى المتجانسة.
  12. تدور المتجانس المخفف في 2000 × غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يحتوي بيليه على خلايا نوى وغير منقطعة.
  13. جمع 1.5 مل من supernatant وتكرار الخطوة 2.12 مرة واحدة.
  14. جمع 1.4 مل من supernatant وتسميتها بأنها ما بعد النووية العملاقة (PNS).

3. كثافة التدرج إعداد العمود

  1. نقل 1.2 مل من PNS إلى أنبوب الطرد المركزي للغاية.
  2. إضافة 1 مل من محلول السكروز 62٪ (2.351 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) إلى العينة وتخلط جيدا عن طريق pipetting لطيف.
    ملاحظة: الحل الناتج هو محلول السكروز 40.6٪.
  3. إضافة 3.3 مل من محلول السكروز 35٪ (1.177 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) بعناية على رأس العينة.
  4. إضافة 2.2 مل من محلول السكروز 25٪ (0.806 M السكروز، 3 mM imidazole في pH 7.4) بعناية على رأس الحل السكروز 35٪.
    ملاحظة: مؤشر الانكسار من 62٪، 40.6٪، 35٪، و 25٪ حلول السكروز في درجة حرارة الغرفة هي 1.44، 1.40، 1.39، و 1.37، على التوالي. ويمكن فحص الفهارس الانكسارية لحلول السكروز باستخدام مقياس الانكسار لضمان دقة التجربة واتساقها.
  5. ملء أنبوب الطرد الفائق مع HB.
    ملاحظة: تخزين عمود تدرج الكثافة المعدة مؤقتا عند 4 درجات مئوية.

4. تجزئة واستعادة إعادة تدوير الكسر المحتوي على الإنسوم

  1. طرد مركزي العمود في 210،000 س ز ل 3 ساعة في 4 درجة مئوية.
  2. جمع 12 كسور (1 مل لكل منهما) بعناية، بدءا من أعلى التدرج.
    ملاحظة: يجب العثور على الاندوسومات إعادة التدوير في واجهة بين حلول السكروز 35٪ و 25٪. يمكن تجميد الكسور المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  3. تمييع جميع الكسور مع 1 مل من تخفيف العازلة (3 mM imidazole في pH 7.4، 1 mM EDTA).
  4. طرد مركزي العينة المخففة في 100،000 س ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. أسبيرات supernatant وإضافة 50 ميكرولتر من 1x عينة العازلة لحصاد الكسور.
  6. تحليل محتويات البروتين في الكسور عن طريق النشاف الغربي.

النتائج

بعد تجزئة خلايا HEK293 غير المصابة حسب التدرج الكثافي للطرد الفائق، تم جمع 12 كسرا بدءا من أعلى التدرج. تم تخفيف الكسور المحصودة مع حاجز التخفيف بنسبة 1:1 وتعرضت لجولة ثانية من الطرد المركزي. ثم تعرضت العينات للنشاف الغربي لتحليل محتويات البروتين الخاصة بها. كما هو مبين في الشكل 1

Discussion

يحدد البروتوكول أعلاه إجراءات عزل الاندوسومات المعاد تدويرها عن الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. وقد ثبت موثوقية هذه الطريقة من خلال أحدث نشر22، مما يثبت أن إعادة تدوير الاندوسومات يتم عزلها بنجاح من العضيات الأخرى(الشكل 1)، مثل جهاز غولجي والم?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل من أموال من مجلس منح البحوث في هونغ كونغ، وخطة المنح المباشرة CUHK، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة، والصندوق الاستئماني الخيري التابع ل TUYF. تم اقتباس الأرقام في هذا العمل من منشورنا السابق ، "ARF6-Rac1 إشارة بوساطة نمو neurite هو potentiated من قبل محول الخلايا العصبية FE65 من خلال تنسيق ARF6 و ELMO1" المنشورة في مجلة FASEB في أكتوبر 2020.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm tissue culture dishSPL20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Sample BufferGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAbCell Signaling Technology4850SRabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucoseHyCloneSH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 antibody (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research GradeHyCloneSV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)AmbionAM4300Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMeasurement of band intensity
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibodySigmaG6160Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAbCell Signaling Technology2276SMouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, DihydrateCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Reduced Serum MediaGibco31985070
PBS TabletsGibco18912014
PhosSTOPRoche4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibodyProteintech20229-1-APRabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300062

References

  1. Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
  2. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
  3. Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
  4. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
  5. Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
  6. Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
  7. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  8. Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
  9. McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
  10. O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
  11. D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
  12. Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
  13. Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
  14. Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).
  15. Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
  16. Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
  17. Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
  18. Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
  19. Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
  20. Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
  21. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  22. Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
  23. Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
  24. Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
  25. Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
  26. Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
  27. Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
  28. Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
  29. Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
  30. Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
  31. Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
  32. Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
  33. Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
  34. Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172 ARF6 Rab11

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved