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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo documento mira a presentare un protocollo per la preparazione del riciclaggio di endosomi da cellule di mammifero utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio.

Abstract

Il traffico endosomiale è un processo cellulare essenziale che regola una vasta gamma di eventi biologici. Le proteine vengono internalizzate dalla membrana plasmatica e quindi trasportate ai primi endosomi. Le proteine internalizzate potrebbero essere transitate al lisosoma per la degradazione o riciclate nella membrana plasmatica. È necessario un robusto percorso di riciclaggio endocitico per bilanciare la rimozione dei materiali di membrana dall'endocitosi. Varie proteine sono segnalate per regolare la via, tra cui ADP-ribosilazione fattore 6 (ARF6). L'ultracentrifugazione del gradiente di densità è un metodo classico per il frazionamento cellulare. Dopo la centrifugazione, gli organelli vengono sedimentati sulla loro superficie isopicnica. Le frazioni vengono raccolte e utilizzate per altre applicazioni a valle. Qui è descritto un protocollo per ottenere una frazione contenente endosomi riciclata da cellule di mammifero trasfettate utilizzando l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Le frazioni isolate sono state sottoposte a western blotting standard per analizzare il loro contenuto proteico. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato che il targeting della membrana plasmatica dell'inghiottimento e della motilità cellulare 1 (ELMO1), un substrato di scambio nucleotidico della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1), avviene attraverso il riciclaggio endocitico mediato da ARF6.

Introduzione

Il traffico endosomiale è un processo fisiologico essenziale che coinvolge vari eventi biologici1, ad esempio il trasporto di recettori di segnalazione, canali ionici e molecole di adesione. Le proteine localizzate nella membrana plasmatica sono internalizzate dall'endocitosi2. Le proteine internalizzate vengono quindi selezionate dall'endosoma precoce3. Alcune delle proteine sono mirate ai lisosomi per la degradazione4. Tuttavia, una quantità significativa di proteine viene riciclata sulla superficie cellulare mediante un rapido riciclaggio e processi di riciclaggio lenti. Nel riciclaggio veloce, le proteine lasciano gli endosomi precoci e ritornano direttamente alla membrana plasmatica. Al contrario, nel riciclaggio lento, le proteine vengono prima selezionate nel compartimento di riciclaggio endocitico e quindi trasportate di nuovo alla membrana plasmatica. Varie proteine di carico, ad esempio clatrina, complesso retromero, complesso retriever e proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e complesso SCAR Homologue (WASH), partecipano a tali processi di riciclaggio della membrana4,5,6,7,8,9. L'equilibrio dell'endocitosi e dell'evento di riciclaggio è cruciale per la sopravvivenza cellulare e contribuisce a vari eventi cellulari10, ad esempio, adesione cellulare, migrazione cellulare, polarità cellulare e trasduzione del segnale.

ARF6, una piccola GTPasi, è un regolatore segnalato del traffico endocitico7,11,12. Di interesse, vari gruppi di ricerca hanno illustrato l'importanza dell'ARF6 nel riciclo endocitico13,14,15,16,17. Lo studio mira a studiare la relazione tra la crescita dei neuriti mediata da ARF6 e il riciclaggio endocitico. Il rapporto precedente suggerisce che l'attivazione di ARF6 è a monte dell'attività di Rac1 attraverso l'azione su ELMO1-dedicatore del complesso di citochinesi 1 (DOCK180)18. Tuttavia, il modo in cui ARF6 attiva la segnalazione Rac1 mediata da ELMO1-DOCK180 rimane poco chiaro. L'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata impiegata per studiare il ruolo del riciclaggio endocitico mediato da ARF6 in tale processo. Usando questo, la frazione contenente endosoma di riciclaggio è stata ottenuta da lisati cellulari19. La frazione è stata sottoposta a Western blotting per l'analisi del contenuto proteico. I risultati dell'immunoblot hanno rivelato che sotto la presenza di FE65, una proteina adattatrice arricchita dal cervello, L'ARF6 attivo ha aumentato sostanzialmente il livello di ELMO1 nella frazione contenente endosoma riciclato. Il seguente protocollo include le procedure per (1) trasfettare le cellule di mammifero; (2) preparazione dei campioni e delle colonne del gradiente di densità; e (3) ottenere la frazione contenente endosomi di riciclaggio.

Protocollo

1. Coltura e trasfezione cellulare di mammiferi

  1. Piastra 2 x 106 celle in una pala di coltura da 100 mm. Utilizzare quattro piatti per ogni trasfezione.
    NOTA: il numero di celle necessarie può variare a seconda delle diverse linee di cella. L'ottimizzazione può essere necessaria prima di procedere alla fase di isolamento.
  2. Il giorno successivo, trasfettare le cellule con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore.

2. Raccolta delle cellule

  1. Scartare il terreno di coltura 48 ore dopo la trasfezione.
  2. Lavare le cellule con PBS ghiacciato (10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio) due volte.
  3. Aggiungere 1 mL di PBS+ ghiacciato (PBS integrato con 0,5x cocktail inibitore della proteasi e 0,5x cocktail inibitore della fosfatasi) a ciascun piatto.
  4. Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 ml.
  5. Pellet le celle mediante centrifugazione utilizzando un rotore a benna oscillante a 400 x g per 5 min.
  6. Scartare il surnatante e risospesciare delicatamente il pellet cellulare in 5 mL di tampone di omogeneizzazione (HB; 250 mM di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4, 1 mM di EDTA integrato con 0,03 mM di cicloeximide, 1x cocktail inibitore della proteasi e 1x cocktail inibitore della fosfatasi).
  7. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.300 x g per 10 min.
  8. Risospesso il pellet di cella in 1 mL di HB.
  9. Omogeneizzare le cellule con un omogeneizzatore Dounce per 15-20 colpi.
    NOTA: potrebbero essere utilizzati altri metodi di omogeneizzazione, ad esempio il passaggio del campione attraverso una siringa. L'efficienza di omogeneizzazione potrebbe essere rivelata osservando l'omogeneizzato al microscopio a contrasto di fase.
  10. Trasferire l'omogeneizzato in un tubo di centrifugazione da 2 ml.
    NOTA: Raccogliere 50 μL di omogeneizzato con 12,5 μL di tampone campione 5x ed etichettarlo come lisato totale.
  11. Aggiungere 0,7 ml di HB all'omogeneizzato.
  12. Ruotare l'omogeneizzato diluito a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: Il pellet contiene nuclei e cellule ininterrotte.
  13. Raccogliere 1,5 ml del surnatante e ripetere il passaggio 2,12 una volta.
  14. Raccogliere 1,4 ml del surnatante ed etichettarlo come surnatante post-nucleare (PNS).

3. Preparazione della colonna del gradiente di densità

  1. Trasferire 1,2 mL di PNS a un tubo ultracentrifuga.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione di saccarosio al 62% (2.351 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7.4) al campione e mescolare bene con un leggero pipettaggio.
    NOTA: La soluzione risultante è una soluzione di saccarosio al 40,6%.
  3. Aggiungere 3,3 mL di soluzione di saccarosio al 35% (1,177 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4) con attenzione sopra il campione.
  4. Aggiungere 2,2 mL di soluzione di saccarosio al 25% (0,806 M di saccarosio, 3 mM di imidazolo a pH 7,4) con attenzione sulla soluzione di saccarosio al 35%.
    NOTA: l'indice di rifrazione delle soluzioni di saccarosio al 62%, 40,6%, 35% e 25% a temperatura ambiente è rispettivamente 1,44, 1,40, 1,39 e 1,37. Gli indici di rifrazione delle soluzioni di saccarosio potrebbero essere controllati con un rifrattometro per garantire la precisione e la coerenza dell'esperimento.
  5. Riempire il tubo di ultracentrifugazione con HB.
    NOTA: conservare temporaneamente la colonna del gradiente di densità preparata a 4 °C.

4. Frazionamento e recupero della frazione contenente endosomi riciclata

  1. Centrifugare la colonna a 210.000 x g per 3 ore a 4 °C.
  2. Raccogliere 12 frazioni (1 mL ciascuna) con attenzione, partendo dalla cima del gradiente.
    NOTA: Gli endosomi di riciclaggio devono essere trovati all'interfaccia tra il 35% e il 25% di soluzioni di saccarosio. Le frazioni raccolte possono essere congelate a scatto in azoto liquido e conservate a -80 °C.
  3. Diluire tutte le frazioni con 1 mL di tampone di diluizione (3 mM di imidazolo a pH 7,4, 1 mM di EDTA).
  4. Centrifugare il campione diluito a 100.000 x g per 1 ora a 4 °C.
  5. Aspirare il surnatante e aggiungere 50 μL di 1x tampone campione per raccogliere le frazioni.
  6. Analizzare il contenuto proteico nelle frazioni mediante western blotting.

Risultati

Dopo aver frazionato le cellule HEK293 non trasfettate mediante ultracentrifugazione del gradiente di densità, sono state raccolte 12 frazioni a partire dalla parte superiore del gradiente. Le frazioni raccolte sono state diluite con il tampone di diluizione in rapporto 1:1 e sottoposte ad un secondo ciclo di centrifugazione. I campioni sono stati quindi sottoposti a western blotting per analizzare il loro contenuto proteico. Come mostrato nella Figura 1, il marcatore endosoma di riciclaggi...

Discussione

Il protocollo di cui sopra delinea le procedure per isolare gli endosomi di riciclaggio dalle cellule coltivate mediante ultracentrifugazione. L'affidabilità di questo metodo è stata dimostrata dall'ultima pubblicazione22, dimostrando che gli endosomi di riciclaggio sono isolati con successo da altri organelli (Figura 1), come l'apparato di Golgi e i mitocondri. Alcuni passaggi critici devono essere prestati attenzione per ottenere un buon risultato di separazione. ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council di Hong Kong, del programma di sovvenzioni dirette CUHK, del fondo di dotazione United College e del TUYF Charitable Trust. Le cifre di questo lavoro sono state adattate dalla nostra precedente pubblicazione, "ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1" pubblicata sul FASEB Journal nell'ottobre 2020.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mmBeckman Coulter347287
100 mm tissue culture dishSPL20100
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman CoulterC14277
5x Sample BufferGenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAbCell Signaling Technology4850SRabbit monoclonal antibody for detecting COX IV.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce Tissue Grinder, 7 mLDWK Life Sciences357542
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucoseHyCloneSH30021.01
ELMO1 antibody (B-7)Santa Cruz BiotechnologySC-271519Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 antibody (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751Goat polyclonal antibody for detecting FE65.
Fetal Bovine Serum, Research GradeHyCloneSV30160.03
GAPDH Monoclonal Antibody (6C5)AmbionAM4300Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH.
ImageLab SoftwareBio-RadMeasurement of band intensity
ImidazoleSigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP antibodySigmaG6160Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) mouse mAbCell Signaling Technology2276SMouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins.
OmniPur EDTA, Disodium Salt, DihydrateCalbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I Reduced Serum MediaGibco31985070
PBS TabletsGibco18912014
PhosSTOPRoche4906845001
RAB11A-Specific Polyclonal antibodyProteintech20229-1-APRabbit polyclonal antibody for detecting Rab11.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter331362
TLA-120.2 Fixed-Angle RotorBeckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300062

Riferimenti

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