Sistema de perfusión pulmonar aislada en el modelo de conejo

Resumen

La preparación aislada del pulmón de conejo es una herramienta estándar de oro en la investigación pulmonar. Esta publicación tiene como objetivo describir la técnica desarrollada para el estudio de los mecanismos fisiológicos y patológicos involucrados en la reactividad de las vías respiratorias, la preservación pulmonar y la investigación preclínica en trasplante pulmonar y edema pulmonar.

Resumen

El sistema de perfusión pulmonar aislada ha sido ampliamente utilizado en la investigación pulmonar, contribuyendo a dilucidar el funcionamiento interno de los pulmones, tanto micro como macroscópicamente. Esta técnica es útil en la caracterización de la fisiología y patología pulmonar mediante la medición de las actividades metabólicas y las funciones respiratorias, incluidas las interacciones entre las sustancias circulatorias y los efectos de las sustancias inhaladas o perfundidas, como en las pruebas de drogas. Mientras que los métodos in vitro implican el corte y cultivo de tejidos, el sistema de perfusión pulmonar ex vivo aislado permite trabajar con un órgano funcional completo haciendo posible el estudio de una función fisiológica continua a la vez que recrea la ventilación y la perfusión. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los efectos de la ausencia de inervación central y el drenaje linfático aún deben evaluarse completamente. Este protocolo tiene como objetivo describir el ensamblaje del aparato pulmonar aislado, seguido de la extracción quirúrgica y la canulación de pulmones y corazón de animales de laboratorio experimentales, así como mostrar la técnica de perfusión y el procesamiento de señales de datos. La viabilidad media del pulmón aislado oscila entre 5-8 h; durante este período, la permeabilidad capilar pulmonar aumenta, causando edema y lesión pulmonar. La funcionalidad del tejido pulmonar preservado se mide mediante el coeficiente de filtración capilar (Kfc), utilizado para determinar la extensión del edema pulmonar a través del tiempo.

Introducción

Brodie y Dixon describieron por primera vez el sistema de perfusión pulmonar ex-vivo en 1903 ¹. Desde entonces, se ha convertido en una herramienta estándar de oro para el estudio de la fisiología, farmacología, toxicología y bioquímica de los ^pulmones2,3. La técnica ofrece una forma consistente y reproducible de evaluar la viabilidad de los trasplantes de pulmón y determinar el efecto de mediadores inflamatorios como la histamina, los metabolitos del ácido araquidónico y la sustancia P, entre otros, así como sus interacciones durante fenómenos pulmonares como la broncoconstricción, la atelectasia y el edema pulmonar. El sistema pulmonar aislado ha sido una técnica clave para desvelar el importante papel de los pulmones en la eliminación de las aminas biogénicas de la circulación ^general4,5. Además, el sistema se ha utilizado para evaluar la bioquímica del surfactante ^pulmonar6. En las últimas décadas, el sistema de perfusión pulmonar ex-vivo se ha convertido en una plataforma ideal para la investigación del trasplante ^pulmonar7. En 2001, un equipo dirigido por Stig Steen describió la primera aplicación clínica del sistema de perfusión pulmonar ex-vivo utilizándolo para reacondicionar los pulmones de un donante de 19 años, que inicialmente fue rechazado por los centros de trasplante debido a sus lesiones. El pulmón izquierdo fue cosechado y perfundido durante 65 min; después, fue trasplantado con éxito a un hombre de 70 años con ^EPOC8. Investigaciones adicionales sobre el reacondicionamiento pulmonar utilizando la perfusión ex-vivo condujeron al desarrollo de la técnica de Toronto para la perfusión pulmonar extendida para evaluar y tratar los pulmones de donantes ^{lesionados9,10}. Clínicamente, el sistema de perfusión pulmonar ex-vivo ha demostrado ser una estrategia segura para aumentar los grupos de donantes mediante el tratamiento y reacondicionamiento de pulmones de donantes por debajo del estándar, sin presentar diferencias significativas en los riesgos o resultados frente a los donantes de criterios ^estándar10.

La principal ventaja del sistema de perfusión pulmonar aislada es que los parámetros experimentales se pueden evaluar en un órgano funcional completo que conserva su función fisiológica bajo una configuración de laboratorio artificial. Además, permite la medición y manipulación de la ventilación mecánica pulmonar para analizar los componentes de la fisiología pulmonar como la resistencia de las vías respiratorias, la resistencia vascular total, el intercambio gaseoso y la formación de edemas, que hasta la fecha no se pueden medir con precisión in vivo en animales de ^laboratorio2. En particular, la composición de la solución con la que se perfunde el pulmón puede controlarse completamente, lo que permite la adición de sustancias para evaluar sus efectos en tiempo real y la recolección de muestras de perfusión para su posterior ^estudio11. Los investigadores que trabajan con el sistema pulmonar aislado deben tener en cuenta que la ventilación mecánica causa la descomposición del tejido pulmonar acortando su tiempo útil. Esta caída progresiva de los parámetros mecánicos puede retrasarse significativamente al hiperinflar los pulmones ocasionalmente durante el tiempo del ^experimento4. Aún así, la preparación no suele durar más de ocho horas. Otra consideración para el sistema de perfusión pulmonar ex-vivo es la ausencia de regulación nerviosa central y drenaje linfático. Los efectos de su ausencia aún no se comprenden completamente y podrían ser una fuente de sesgo en ciertos experimentos.

La técnica del sistema de perfusión pulmonar aislada se puede realizar en el modelo de conejo con un alto grado de consistencia y reproducibilidad. Este trabajo describe los procedimientos técnicos y quirúrgicos para la implementación de la técnica de perfusión pulmonar aislada ex-vivo desarrollada para el modelo de conejo en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias en la Ciudad de México, con la intención de compartir las ideas y proporcionar una guía clara sobre los pasos clave en la aplicación de este modelo experimental.

Protocolo

El sistema de perfusión aislada en el modelo de conejo ha sido ampliamente utilizado en el Laboratorio de Hiperrespuesta Bronquial del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. El protocolo incluye conejos de Nueva Zelanda con un peso aproximado de 2,5-3 kg. Todos los animales fueron mantenidos en condiciones estándar de vivero y alimentación ad libitum de conformidad con las directrices oficiales mexicanas para animales de laboratorio (NOM 062-ZOO-1999) y bajo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (^8ª edición, 2011). Todos los procedimientos y métodos de cuidado animal presentados en este protocolo fueron previamente aprobados por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

NOTA: La preparación del sistema de perfusión pulmonar aislada implica la muerte deliberada de un animal bajo anestesia y mediante eutanasia.

1. Equipo y preparación de aparatos.

1. Disposición del equipo:
   1. Configure una mesa de operaciones con tamaño de acuerdo con el peso del conejo.
   2. Monte la cubierta del tórax artificial en la columna de acero con la cámara de vidrio debajo y el ventilador con una bomba de rodillos a los lados.
   3. Asegúrese de que la cubierta se incline fácilmente para tener la cánula traqueal en línea con la tráquea para permitir una conexión más rápida.
2. Tórax artificial:
   NOTA: Es una parte esencial del sistema. Consiste en una cámara de vidrio con camisa de agua sellada por una cubierta especial. La cubierta funciona como el soporte del órgano con las conexiones para cannular la tráquea y los vasos incrustados en ella.
   1. Configure un chorro venturi operado por aire comprimido para generar la presión negativa dentro del tórax artificial.
      NOTA: El módulo de control de ventilación (VCM) permite ajustes separados de las presiones inspiratoria y espiratoria final, así como la frecuencia respiratoria y la relación entre la duración inspiratoria y la duración total del ciclo.
3. Aparato:
   1. Asegúrese de que un aparato que funciona normalmente consiste en una columna de acero principal montada en una placa base que sostiene el tórax artificial, con el neumotacómetro y el transductor de peso ubicados sobre él y detrás de la bobina de precalentamiento con una trampa de burbujas.
   2. Conecte un transductor de presión diferencial al neumotacómetro y otro a la presión de la cámara. Coloque un par diferente de transductores de presión detrás del tórax para medir la perfusión y las presiones venosas.
   3. Conecte la culata de cambio debajo del oxigenador con un electrodo de nivel y el sistema de ventilación al lado del aparato.

2. Extracción quirúrgica del bloqueo cardiopulmonar.

1. Anestesia:
   1. Use una combinación de un sedante (xilazina) y un barbitúrico (pentobarbital).
      NOTA: Se pueden usar diferentes cócteles anestésicos sin ningún efecto sobre los resultados experimentales.
   2. Primero, sedar a los conejos sanos de Nueva Zelanda con una sola inyección intramuscular de clorhidrato de xilazina (3-5 mg / kg). Asegúrese de que los conejos permanezcan tranquilos y relajados para permitir una mayor manipulación después de unos minutos de la inyección.
   3. Después de la sedación, use las venas marginales (laterales) del oído como acceso para anestesiar a los conejos con una inyección intravenosa de pentobarbital sódico (28 mg / kg).
2. Monitorización:
   1. Para evitar la anestesia insuficiente o la depresión excesiva de las funciones cardíacas y respiratorias, controle los siguientes parámetros. Para evaluar la profundidad de la anestesia, realice una prueba de pellizco del dedo del pie.
   2. Asegúrese de que la membrana mucosa sea rosada. Los tonos azules o grises indican hipoxia.
   3. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca esté entre 120-135 latidos / min, y que la temperatura corporal no baje de 36.5 ° C.
3. Colocación de animales:
   1. Afeitar el torso del conejo y colocar al animal en la mesa de operaciones en posición supina. Coloque el sistema de ventilación cerca de la mesa, detrás de la cabeza del conejo, para permitir conectar las cánulas rápidamente después de la traqueotomía para evitar daños tisulares.
4. Incisión y traqueotomía:
   1. Diseccionar la piel con una incisión ventral en la línea mediana de 3-5 cm desde el diafragma hasta el cuello.
   2. Con las tijeras operativas, corte los 2/3 anteriores de la tráquea entre dos anillos de cartílago para insertar la cánula traqueal a través de la membrana fibrosa traqueal.
   3. Inserte un 5 mm (diámetro exterior; OD) cánula traqueal a través de la membrana fibrosa traqueal y use una sutura de seda 4-0 para fijarla con cuidado.
   4. Coloque pinzas o pinzas debajo de la tráquea para asegurarse de que la cánula no se doble contra la tráquea.
5. Ventilación con presión positiva:
   1. Mientras los pulmones permanezcan fuera del tórax artificial, use una pequeña bomba de respiración para ventilar una presión positiva con el fin de evitar el colapso pulmonar durante la cirugía.
   2. Inicie la ventilación a través de la cánula traqueal conectada a la bomba de respiración rápidamente después de la traqueotomía y antes de que se abra el tórax.
   3. Ajuste el volumen corriente a 10 ml/kg.
      NOTA: Dependiendo de la configuración del experimento y el modelo de tórax artificial, proporcione ventilación de presión positiva mediante la misma bomba de ventilación utilizada para proporcionar presión negativa o una diferente, lo que garantiza una re-canulación rápida.
6. Toracotomía y exsanguinación:
   1. Para acceder a la cavidad torácica, use un bisturí o tijeras para abrir la pared del tórax y realizar una esternotomía medial hasta el tercio superior del tórax.
   2. Mantenga las mitades del tórax abiertas por dos retractores. Varios colgajos pulmonares generalmente rodean el corazón.
   3. Localiza la vena cava superior e inferior y remítela con hilos.
   4. Antes de la exsanguinación del animal, identifique el ventrículo derecho e inyecte 1000 UI/kg de heparina.
   5. Inmediatamente después de la inyección, ligar la vena cava superior e inferior con el hilo pre-asado y realizar la exsanguinación.
7. Cosecha corazón-pulmón:
   1. Cosecha el bloque cardiopulmonar suave y rápidamente. Use disección digital directa o tijeras de resorte para separar el tejido conectivo a fin de extraer los pulmones del tórax.
   2. Diseccionar la vasculatura en el área, así como el esófago.
   3. Cortar a través del manubrium sterni para extender la esternotomía medial hacia la cánula traqueal, liberando la tráquea en ambos lados del tejido de conexión.
   4. Ahora, reseque la tráquea por encima de la cánula traqueal. Tire suavemente de la cánula en un eje craneocaudal a medida que se reseca la fijación dorsal de la tráquea y los pulmones.
8. Canulación:
   1. Levante los pulmones aislados del tórax y colóquelos cuidadosamente sobre una gasa estéril en una placa de Petri.
   2. Para prevenir la atelectasia, ventile los pulmones mediante ventilación con presión positiva con presión positiva al final de la espiración (PEEP) establecida en 2 _cmH2O.
   3. Retire los ventrículos cortándolos del corazón a nivel del surco auriculoventricular.
   4. Después de abrir los dos ventrículos, introduzca la cánula de la arteria pulmonar OD de 4,6 mm para el conejo con una cesta a través de la arteria pulmonar e introduzca la cánula de la aurícula izquierda de OD de 5,9 mm para el conejo con la cesta a través de la válvula mitral en la aurícula izquierda.
   5. Use una sutura de seda 4-0 en la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para fijar las cánulas. Incluya los tejidos circundantes en las ligaduras de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para evitar la distensión de estas estructuras.
   6. Inyecte 250 ml de solución isotónica salina a través de las cánulas arteriales para eliminar la sangre restante del lecho vascular.

3. Técnica de perfusión.

1. Arreglo:
   1. Coloque los pulmones aislados cuidadosamente en la cámara pulmonar.
   2. Conecte la tráquea al transductor en la cubierta de la cámara.
   3. Conecte los vasos canulados al sistema de perfusión.
   4. Cierre la cámara y asegúrela con la cerradura giratoria.
      NOTA: El circuito de perfusión de recirculación consiste en un depósito venoso abierto, una bomba peristáltica, un intercambiador de calor y una trampa de burbujas.
   5. En este punto, conecte la tapa de la cámara y cambie sobre una llave de paso para cambiar de ventilación de presión positiva a negativa. Para verificar la ventilación con presión negativa de los pulmones y el cierre hermético de la cámara, inspeccione la excursión respiratoria del pulmón y la presión de la cámara en el manómetro.
   6. Perfundir los pulmones con 200 ml de perfusato artificial libre de sangre (un tampón de bicarbonato krebs-Ringer que contiene 2,5% de albúmina bovina).
   7. Comience el flujo de perfusato a 3 ml / min / kg, luego aumente lentamente el flujo durante un período de 5 minutos a 5 ml / min / kg. Alcance un flujo de 8 ml / min / kg durante los siguientes 5 minutos y luego después de otro período de 5 minutos alcance un flujo máximo de 10 ml / min / kg. Tenga cuidado de evitar que el aire entre en el circuito.
      NOTA: Mantenga el pH y la temperatura del perfusato dentro de los rangos fisiológicos (pH 7.4-7.5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar el pH, agregue _NaHCO3 (1N) o aumente el flujo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0.1N) para acidificar.
2. Parámetros:
   1. Compruebe si los parámetros predeterminados de perfusión y ventilación se establecen según sea necesario.
   2. Ventilar los pulmones con aire humidificado a una frecuencia de 30 lpm, un volumen corriente de 10 mL/kg y una presión espiratoria final (Pe) de 2 _cmH2O.
      NOTA: La presión arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde a la altura del nivel de líquido en el oxigenador o reservorio en centímetros por encima del tronco pulmonar, mientras que la presión venosa pulmonar corresponde a la altura de la cámara de equilibrio de presión por encima de la aurícula izquierda. Ambos valores se pueden modificar. Tenga en cuenta que la presión de la aurícula izquierda también es de 0-20 mmHg.
3. Lograr las condiciones de la zona 3:
   1. Use los dos catéteres conectados a los puertos laterales de las cánulas aseguradas en la arteria pulmonar, la aurícula izquierda y los transductores de presión para medir las presiones arterial (Pa) y venosa (Pv).
   2. Establezca las presiones basales a nivel del hilio pulmonar (Referencia cero).
   3. Realizar los experimentos en condiciones de ventilación de zona 3. Para lograr esto, espere 10-15 min para obtener un equilibrio caracterizado por un estado isogravimétrico.
   4. Asegúrese de que la presión venosa sea más alta que la presión alveolar (Palv) y que la presión arterial permanezca más alta que ambas (Pa > Pv > Palv) para que ocurran las condiciones de la Zona 3.
   5. Asegúrese de que el peso de los pulmones permanezca constante y que las presiones arterial y auricular izquierda sean estables para lograr las condiciones de la zona 3 para abrir un número máximo de vasos pulmonares y mantener el contenido del lecho microvascular durante el experimento.
      NOTA: La medición de Kfc como indicador de edema pulmonar no tiene variación entre un sistema de perfusión manual y uno automático.
4. Control electrónico y procesamiento de señales: Asegurar que el flujo respiratorio, los cambios de peso, la presión microvascular, el volumen corriente, la resistencia vascular, entre otros, se registren en una unidad electrónica central múltiple que integra las señales provenientes de los transductores y las muestra en el sistema de evaluación.

Resultados

El sistema de perfusión pulmonar aislada permite la manipulación de órganos para biopsia, la recolección de muestras de perfusión y la recopilación de datos en tiempo real de parámetros fisiológicos. El sistema aislado se puede utilizar para probar muchas hipótesis que involucran diferentes funciones y fenómenos pulmonares, desde la actividad metabólica y enzimática hasta la formación de edemas y los períodos de preservación para trasplantes de pulmón.

La F...

Discusión

Este trabajo muestra una visión general del sistema de perfusión pulmonar aislada, una técnica esencial en la investigación de la fisiología pulmonar. El sistema de perfusión pulmonar aislada ofrece un gran grado de versatilidad en sus usos y permite la evaluación de varios parámetros relevantes en la prueba de una amplia gama de ^hipótesis15. Un sistema pulmonar aislado es una herramienta con presencia mundial que, en la última década, ha establecido aún más su relevancia para las eva...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder	sigma	3912	500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Cryogenic vials	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade	Caledon
Falcon tubes			14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	PISA		5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Microcentrifuge Tube	Corning	430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potassium chloride, KCl.	JT Baker	3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)	PISA	Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube	Costar	3620	1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3	sigma	S6014
Sodium chloride, NaCl.	sigma	S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes	Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163