Système de perfusion pulmonaire isolé dans le modèle de lapin

Résumé

La préparation pulmonaire isolée du lapin est un outil de référence dans la recherche pulmonaire. Cette publication vise à décrire la technique telle que développée pour l’étude des mécanismes physiologiques et pathologiques impliqués dans la réactivité des voies respiratoires, la préservation des poumons et la recherche préclinique dans la transplantation pulmonaire et l’œdème pulmonaire.

Résumé

Le système de perfusion pulmonaire isolé a été largement utilisé dans la recherche pulmonaire, contribuant à élucider le fonctionnement interne des poumons, à la fois micro et macroscopique. Cette technique est utile dans la caractérisation de la physiologie et de la pathologie pulmonaires en mesurant les activités métaboliques et les fonctions respiratoires, y compris les interactions entre les substances circulatoires et les effets des substances inhalées ou perfusées, comme dans les tests de drogues. Alors que les méthodes in vitro impliquent le tranchage et la culture de tissus, le système de perfusion pulmonaire ex vivo isolé permet de travailler avec un organe fonctionnel complet rendant possible l’étude d’une fonction physiologique continue tout en recréant la ventilation et la perfusion. Cependant, il convient de noter que les effets de l’absence d’innervation centrale et de drainage lymphatique doivent encore être pleinement évalués. Ce protocole vise à décrire l’assemblage de l’appareil pulmonaire isolé, suivi de l’extraction chirurgicale et de la canulation des poumons et du cœur à partir d’animaux de laboratoire expérimentaux, ainsi qu’à afficher la technique de perfusion et le traitement du signal des données. La viabilité moyenne du poumon isolé varie entre 5 et 8 h; pendant cette période, la perméabilité capillaire pulmonaire augmente, provoquant un œdème et des lésions pulmonaires. La fonctionnalité du tissu pulmonaire préservé est mesurée par le coefficient de filtration capillaire (Kfc), utilisé pour déterminer l’étendue de l’œdème pulmonaire dans le temps.

Introduction

Brodie et Dixon ont décrit pour la première fois le système de perfusion pulmonaire ex-vivo en 1903 ¹. Depuis lors, il est devenu un outil de référence pour étudier la physiologie, la pharmacologie, la toxicologie et la biochimie des ^poumons2,3. La technique offre un moyen cohérent et reproductible d’évaluer la viabilité des greffes de poumons et de déterminer l’effet des médiateurs inflammatoires tels que l’histamine, les métabolites de l’acide arachidonique et la substance P, entre autres, ainsi que leurs interactions lors de phénomènes pulmonaires tels que la bronchoconstriction, l’atélectasie et l’œdème pulmonaire. Le système pulmonaire isolé a été une technique clé pour dévoiler le rôle important des poumons dans l’élimination des amines biogènes de la circulation ^{générale4,5}. De plus, le système a été utilisé pour évaluer la biochimie du surfactant ^pulmonaire6. Au cours des dernières décennies, le système de perfusion pulmonaire ex vivo est devenu une plate-forme idéale pour la recherche sur la transplantation ^pulmonaire7. En 2001, une équipe dirigée par Stig Steen a décrit la première application clinique du système de perfusion pulmonaire ex-vivo en l’utilisant pour reconditionner les poumons d’un donneur de 19 ans, initialement rejeté par les centres de transplantation en raison de ses blessures. Le poumon gauche a été prélevé et perfusé pendant 65 minutes; par la suite, il a été transplanté avec succès chez un homme de 70 ans atteint de ^BPCO8. D’autres recherches sur le reconditionnement des poumons à l’aide de la perfusion ex vivo ont mené à la mise au point de la technique torontoise de perfusion pulmonaire prolongée pour évaluer et traiter les poumons de donneurs blessés9,10. Sur le plan clinique, le système de perfusion pulmonaire ex vivo s’est avéré être une stratégie sûre pour augmenter les bassins de donneurs en traitant et en reconditionnant les poumons de donneurs inférieurs aux normes, ne présentant aucune différence significative dans les risques ou les résultats par rapport aux donneurs critères ^standard10.

Le principal avantage du système de perfusion pulmonaire isolée est que les paramètres expérimentaux peuvent être évalués dans un organe fonctionnel complet qui préserve sa fonction physiologique dans une configuration de laboratoire artificiel. En outre, il permet la mesure et la manipulation de la ventilation mécanique pulmonaire pour analyser les composants de la physiologie pulmonaire tels que la résistance des voies respiratoires, la résistance vasculaire totale, les échanges gazeux et la formation d’œdèmes, qui à ce jour ne peuvent pas être mesurés avec précision in vivo sur des animaux de ^laboratoire2. Notamment, la composition de la solution avec laquelle le poumon est perfusé peut être entièrement contrôlée, ce qui permet l’ajout de substances pour évaluer leurs effets en temps réel et le prélèvement d’échantillons à partir de la perfusion pour une étude plus ^{approfondie11}. Les chercheurs travaillant avec le système pulmonaire isolé doivent garder à l’esprit que la ventilation mécanique provoque la carie du tissu pulmonaire raccourcissant son temps utile. Cette chute progressive des paramètres mécaniques peut être considérablement retardée par hypergonflage des poumons occasionnellement pendant la durée de l’expérience4. Pourtant, la préparation ne peut généralement pas durer plus de huit heures. Une autre considération pour le système de perfusion pulmonaire ex-vivo est l’absence de régulation nerveuse centrale et de drainage lymphatique. Les effets de leur absence ne sont pas encore entièrement compris et pourraient potentiellement être une source de biais dans certaines expériences.

La technique du système de perfusion pulmonaire isolée peut être réalisée dans le modèle de lapin avec un degré élevé de cohérence et de reproductibilité. Ce travail décrit les procédures techniques et chirurgicales pour la mise en œuvre de la technique de perfusion pulmonaire isolée ex-vivo telle que développée pour le modèle de lapin à l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias à Mexico, dans le but de partager les idées et de fournir un guide clair sur les étapes clés dans l’application de ce modèle expérimental.

Protocole

Le système de perfusion isolé dans le modèle de lapin a été largement utilisé dans le laboratoire d’hyperréactivité bronchique de l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Le protocole inclut les lapins néo-zélandais d’un poids approximatif de 2,5 à 3 kg. Tous les animaux ont été gardés dans des conditions de vivarium standard et nourris ad libitum conformément aux directives officielles mexicaines pour les animaux de laboratoire (NOM 062-ZOO-1999) et au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (^8e édition, 2011). Toutes les procédures animales et les méthodes de soins aux animaux présentées dans ce protocole ont été préalablement approuvées par le Comité d’éthique de l’Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

REMARQUE: La préparation du système de perfusion pulmonaire isolé implique la mort délibérée d’un animal sous anesthésie et par euthanasie.

1. Équipement et préparation des appareils.

1. Disposition de l’équipement :
   1. Installez une table d’opération avec une taille en fonction du poids du lapin.
   2. Montez le couvercle du thorax artificiel sur la colonne en acier avec la chambre en verre en dessous et le ventilateur avec une pompe à rouleaux sur les côtés.
   3. Assurez-vous que la couverture est facilement inclinée pour avoir la canule trachéale alignée avec la trachée pour permettre une connexion plus rapide.
2. Thorax artificiel :
   REMARQUE: C’est une partie essentielle du système. Il se compose d’une chambre en verre enveloppée d’eau scellée par un couvercle spécial. La couverture fonctionne comme le porte-organe avec les connexions pour canuler la trachée et les vaisseaux qui y sont intégrés.
   1. Installez un jet de venturi actionné par de l’air comprimé pour générer la pression négative à l’intérieur du thorax artificiel.
      REMARQUE: Le module de contrôle de la ventilation (VCM) permet des ajustements séparés des pressions inspiratoires et expiratoires ainsi que de la fréquence respiratoire et du rapport entre la durée inspiratoire et la durée totale du cycle.
3. Appareil:
   1. Assurez-vous qu’un appareil fonctionnant normalement se compose d’une colonne principale en acier montée sur une plaque de base tenant le thorax artificiel, avec le pneumotachymètre et le transducteur de poids situés au-dessus et derrière la bobine de préchauffage avec un piège à bulles.
   2. Connectez un transducteur de pression différentielle au pneumotachymètre et un autre à la pression de la chambre. Placez un couple différent de transducteurs de pression derrière le thorax pour mesurer la perfusion et les pressions veineuses.
   3. Connectez le stock de changement sous l’oxygénateur avec une électrode de niveau et le système de ventilation à côté de l’appareil.

2. Extraction chirurgicale du bloc cardiopulmonaire.

1. Anesthésie:
   1. Utilisez une combinaison d’un sédatif (xylazine) et d’un barbiturique (pentobarbital).
      REMARQUE: Différents cocktails anesthésiques peuvent être utilisés sans effet sur les résultats expérimentaux.
   2. Tout d’abord, sédater les lapins néo-zélandais en bonne santé avec une seule injection intramusculaire de chlorhydrate de xylazine (3-5 mg / kg). Assurez-vous que les lapins restent calmes et détendus pour permettre une manipulation ultérieure après quelques minutes de l’injection.
   3. Après la sédation, utiliser les veines auriculaires marginales (latérales) comme accès pour anesthésier les lapins avec une injection intraveineuse de pentobarbital sodique (28 mg / kg).
2. Surveillance:
   1. Pour éviter une anesthésie insuffisante ou une dépression excessive des fonctions cardiaques et respiratoires, surveillez les paramètres suivants. Pour évaluer la profondeur de l’anesthésie, effectuez un test de pincement des orteils.
   2. Assurez-vous que la membrane muqueuse est rose. Les nuances bleues ou grises indiquent une hypoxie.
   3. Assurez-vous que la fréquence cardiaque se situe entre 120 et 135 battements/min et que la température corporelle ne descend pas en dessous de 36,5 °C.
3. Placement de l’animal :
   1. Rasez le torse du lapin et placez l’animal sur la table d’opération en position couchée. Placez le système de ventilation près de la table, derrière la tête du lapin, pour permettre de connecter les canules rapidement après la trachéotomie afin d’éviter des dommages tissulaires.
4. Incision et trachéotomie :
   1. Disséquez la peau avec une incision de la ligne médiane ventrale de 3 à 5 cm du diaphragme jusqu’au cou.
   2. Avec les ciseaux opératoires, coupez les 2/3 antérieurs de la trachée entre deux anneaux cartilagineux pour insérer la canule trachéale à travers la membrane fibreuse trachéale.
   3. Insérez un 5 mm (diamètre extérieur; OD) canule trachéale à travers la membrane fibreuse trachéale et utilisez une suture de soie 4-0 pour la fixer soigneusement.
   4. Placez une pince ou une pince à épiler sous la trachée pour vous assurer que la canule ne se plie pas contre la trachée.
5. Ventilation à pression positive :
   1. Tant que les poumons restent à l’extérieur du thorax artificiel, utilisez une pompe respiratoire de petite espèce pour ventiler une pression positive afin d’éviter l’effondrement des poumons pendant la chirurgie.
   2. Initier la ventilation par la canule trachéale reliée à la pompe respiratoire rapidement après la trachéotomie et avant l’ouverture du thorax.
   3. Réglez le volume courant à 10 mL/kg.
      REMARQUE: Selon la configuration de l’expérience et le modèle de thorax artificiel, fournir une ventilation en pression positive par la même pompe de ventilation utilisée pour fournir une pression négative ou une autre, ce qui permet une recanulation rapide.
6. Thoracotomie et exsanguination :
   1. Pour accéder à la cavité thoracique, utilisez un scalpel ou des ciseaux pour ouvrir la paroi du thorax et effectuez une sternotomie médiale jusqu’au tiers supérieur du thorax.
   2. Maintenez les moitiés du thorax ouvertes par deux rétracteurs. Plusieurs battements de poumon entourent généralement le cœur.
   3. Localisez la veine cave supérieure et inférieure et référez-les avec des fils.
   4. Avant l’exsanguination de l’animal, identifiez le ventricule droit et injectez 1000 UI/kg d’héparine.
   5. Immédiatement après l’injection, ligaturez la veine cave supérieure et inférieure avec le fil pré-bouclé et effectuez une exsanguination.
7. Récolte cœur-poumon :
   1. Récoltez le bloc cardiopulmonaire doucement et rapidement. Utilisez une dissection numérique directe ou des ciseaux à ressort pour séparer le tissu conjonctif de manière à retirer les poumons du thorax.
   2. Disséquez le système vasculaire dans la région, ainsi que l’œsophage.
   3. Couper à travers le manubrium sterni pour étendre la sternotomie médiale vers la canule trachéale, libérant la trachée des deux côtés du tissu de connexion.
   4. Maintenant, réséquez la trachée au-dessus de la canule trachéale. Tirez doucement la canule dans un axe craniocaudal pendant que la fixation dorsale de la trachée et des poumons est réséquée.
8. Canulation:
   1. Soulevez les poumons isolés du thorax et placez-les soigneusement sur une gaze stérile sur une boîte de Pétri.
   2. Pour prévenir l’atélectasie, ventilez les poumons à l’aide d’une ventilation à pression positive avec une pression expiratoire positive (PEEP) fixée à 2 _cmH2O.
   3. Retirez les ventricules en les coupant du cœur au niveau de la rainure auriculo-ventriculaire.
   4. Après avoir ouvert les deux ventricules, introduire la canule de l’artère pulmonaire OD 4,6 mm pour le lapin avec un panier à travers l’artère pulmonaire et introduire la canule de l’oreillette gauche OD 5,9 mm pour le lapin avec le panier à travers la valve mitrale dans l’oreillette gauche.
   5. Utilisez une suture de soie 4-0 dans l’artère pulmonaire et l’oreillette gauche pour fixer les canules. Inclure les tissus environnants dans les ligatures de l’artère pulmonaire et de l’oreillette gauche pour éviter la distension de ces structures.
   6. Injecter 250 mL de solution isotonique saline à travers les canules artérielles pour rincer le sang restant du lit vasculaire.

3. Technique de perfusion.

1. Coup monté:
   1. Placez soigneusement les poumons isolés dans la chambre pulmonaire.
   2. Fixez la trachée au transducteur sur le couvercle de la chambre.
   3. Connectez les vaisseaux cannulés au système de perfusion.
   4. Fermez la chambre et fixez-la avec la serrure rotative.
      REMARQUE: Le circuit de perfusion à recirculation se compose d’un réservoir veineux ouvert, d’une pompe péristaltique, d’un échangeur de chaleur et d’un piège à bulles.
   5. À ce stade, fixez le couvercle de la chambre et passez sur un robinet d’arrêt pour passer de la ventilation à pression positive à la ventilation à pression négative. Pour vérifier la ventilation à pression négative des poumons et la fermeture étanche à l’air de la chambre, inspectez l’excursion respiratoire du poumon et la pression de la chambre sur le manomètre.
   6. Perfuser les poumons avec 200 mL de perfusat artificiel sans sang (un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant 2,5% d’albumine bovine).
   7. Commencez le débit de perfusat à 3 mL/min/kg, puis augmentez lentement le débit sur une période de 5 minutes jusqu’à 5 mL/min/kg. Atteignez un débit de 8 mL/min/kg au cours des 5 minutes suivantes, puis après une autre période de 5 minutes, atteignez un flux maximal de 10 mL/min/kg. Prenez soin d’éviter que l’air ne pénètre dans le circuit.
      REMARQUE: Maintenir le pH et la température du perfusat dans les plages physiologiques (pH 7,4-7,5; température, 37 °C-38 °C). Pour ajuster le pH, ajoutez Du _NaHCO3 (1N) ou augmentez le flux de dioxyde de carbone. Vous pouvez également utiliser du HCl (0,1 N) pour acidifier.
2. Paramètres:
   1. Vérifiez si les paramètres de perfusion et de ventilation prédéterminés sont réglés au besoin.
   2. Ventiler les poumons avec de l’air humidifié à une fréquence de 30 bpm, un volume courant de 10 mL/kg et une pression expiratoire finale (Pe) de 2 _cmH2O.
      REMARQUE: La pression artérielle pulmonaire (0-20 mmHg) correspond à la hauteur du niveau de liquide dans l’oxygénateur ou le réservoir en centimètres au-dessus du tronc pulmonaire, tandis que la pression veineuse pulmonaire correspond à la hauteur de la chambre d’équilibrage de pression au-dessus de l’oreillette gauche. Les deux valeurs peuvent être modifiées. Notez que la pression de l’oreillette gauche est également de 0 à 20 mmHg.
3. Atteindre les conditions de la zone 3 :
   1. Utilisez les deux cathéters reliés aux orifices latéraux des canules fixées dans l’artère pulmonaire, l’oreillette gauche et les transducteurs de pression pour mesurer les pressions artérielle (Pa) et veineuse (Pv).
   2. Réglez les pressions de base au niveau du hile pulmonaire (référence zéro).
   3. Mener les expériences dans des conditions de ventilation de la zone 3. Pour y parvenir, attendez 10-15 min pour obtenir un équilibre caractérisé par un état isogravimétrique.
   4. Assurez-vous que la pression veineuse est supérieure à la pression alvéolaire (Palv) et que la pression artérielle reste supérieure aux deux (Pa > Pv > Palv) pour que les conditions de la zone 3 se produisent.
   5. Assurez-vous que le poids des poumons reste constant et que les pressions artérielles et auriculaires gauches sont stables pour atteindre les conditions de la zone 3 afin d’ouvrir un nombre maximal de vaisseaux pulmonaires et de maintenir le contenu du lit microvasculaire pendant l’expérience.
      REMARQUE: La mesure de Kfc en tant qu’indicateur d’œdème pulmonaire n’a aucune variation entre un système de perfusion manuel et automatique.
4. Contrôle électronique et traitement du signal: Assurez-vous que le flux respiratoire, les changements de poids, la pression microvasculaire, le volume courant, la résistance vasculaire, entre autres, sont enregistrés sur une unité électronique centrale multiple qui intègre les signaux provenant des transducteurs et les affiche sur le système d’évaluation.

Résultats

Le système de perfusion pulmonaire isolé permet la manipulation d’organes pour la biopsie, la collecte d’échantillons de perfusion et la collecte de données en temps réel de paramètres physiologiques. Le système isolé peut être utilisé pour tester de nombreuses hypothèses impliquant différentes fonctions et phénomènes pulmonaires, de l’activité métabolique et enzymatique à la formation d’œdème et aux périodes de conservation pour les greffes pulmonaires.

Discussion

Ce travail présente une vue d’ensemble du système de perfusion pulmonaire isolé, une technique essentielle dans la recherche en physiologie pulmonaire. Le système de perfusion pulmonaire isolée offre un grand degré de polyvalence dans ses utilisations et permet l’évaluation de plusieurs paramètres pertinents dans le test d’un large éventail d’hypothèses15. Un système pulmonaire isolé est un outil présent dans le monde entier qui, au cours de la dernière décennie, a encore é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder	sigma	3912	500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Cryogenic vials	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade	Caledon
Falcon tubes			14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	PISA		5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Microcentrifuge Tube	Corning	430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potassium chloride, KCl.	JT Baker	3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)	PISA	Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube	Costar	3620	1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3	sigma	S6014
Sodium chloride, NaCl.	sigma	S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes	Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163