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  • 転載および許可

要約

孤立したウサギの肺の準備は肺の調査の金の標準的な用具である。この出版物は、気道反応性、肺保存、肺移植および肺水腫における前臨床研究に関与する生理学的および病理学的メカニズムの研究のために開発された技術を説明することを目的とする。

要約

孤立した肺灌流システムは肺の研究で広く使用されており、肺の内部の働き(マイクロおよびマクロ的)の解明に寄与している。この技術は、循環物質間の相互作用や吸入または浸透物質の影響を含む代謝活動および呼吸機能を測定することによって、肺生理学および病理の特性評価に有用である。 in vitro の方法は組織のスライスと培養を伴うが、孤立した ex vivo 肺灌流システムは、換気および灌流を再現しながら、連続的な生理機能の研究を可能にする完全な機能器官で働くことを可能にする。しかし、中枢的な内挿およびリンパドレナージの欠如の影響は、依然として十分に評価されなければならないことに留意すべきである。このプロトコルは、孤立した肺装置の組み立てを記述し、実験用実験動物からの肺および心臓の外科的抽出およびカヌル化を記述し、また、データの灌流技術および信号処理を表示することを目的とする。孤立した肺の平均生存率は5〜8時間の範囲である。この間、肺毛細血管の透過性が増加し、浮腫および肺損傷を引き起こす。保存された肺組織の機能は、毛細管濾過係数(Kfc)によって測定され、経時肺水腫の程度を決定するために使用される。

概要

ブロディとディクソンは、1903年1月に最初に元生体肺灌流システムを説明した。それ以来、肺2,3の生理学、薬理学、毒物学、生化学を研究するためのゴールドスタンダードツールとなっています。この技術は、肺移植の生存率を評価し、ヒスタミン、アラキドン酸代謝物、物質Pなどの炎症性メディエーターの効果と、気管支収縮、アテクサシス、肺水腫などの肺現象中の相互作用を決定するための一貫した再現可能な方法を提供する。孤立した肺系は、一般的な循環からの生物起源アミンの除去における肺の重要な役割を明らかにする上で重要な技術であった4,5。さらに、このシステムは、肺界面活性剤の生化学を評価するために使用されています6。過去数十年にわたり、元生体肺灌流システムは肺移植研究のための理想的なプラットフォームとなっています7。2001年、スティグ・スティーンのチームリーダーは、元生体肺灌流システムの最初の臨床応用を説明し、19歳のドナーの肺を再調整し、最初に怪我のために移植センターによって拒絶された。左肺は収穫され、65分間浸透した。その後、COPD8を持つ70歳の男性に移植に成功しました。元生体灌流を用いた肺再調節のさらなる研究は、負傷したドナー肺を評価し、治療するための拡張肺灌流のためのトロント技術を開発することにつながった9,10。臨床的には、元生体肺灌流システムは、標準下のドナー肺を治療および再調整することによってドナープールを増加させる安全な戦略であることを示しており、標準基準ドナー10に対するリスクまたは結果に有意な差を示さない。

孤立した肺灌流システムの主な利点は、実験パラメータが人工実験室のセットアップの下でその生理機能を維持する完全な機能器官で評価することができるということです。さらに、肺の機械的換気の測定と操作により、肺生理学の成分(気道抵抗、全血管抵抗、ガス交換、浮腫形成など)を分析することができ、現在までにはラボ動物 の生体内で正確に 測定することはできません2。特に、肺が浸透する溶液の組成を完全に制御することができ、物質の添加は、リアルタイムでそれらの効果を評価し、さらなる研究のための灌流からのサンプル採取を可能にする11。孤立した肺系を扱う研究者は、機械的換気が肺組織の崩壊を引き起こし、その有用な時間を短縮することを念頭に置くべきである。この機械的パラメータの進行性の低下は、実験中に時折肺を高膨張させることによって著しく遅れることがある4。それでも、準備は通常8時間以上続くことはできません。 元生体肺 灌流系のもう一つの考慮事項は、中枢神経系調節およびリンパドレナージの欠如である。彼らの不在の影響はまだ完全には理解されておらず、特定の実験におけるバイアスの原因となる可能性があります。

分離肺灌流システム技術は、高い一貫性と再現性を有するウサギモデルで行うことができる。この研究は、メキシコシティのインスティトゥート・ナシオナル・デ・エンフェルメダーデス・レスピラトリアスでウサギモデルのために開発された 元生体 単離肺灌流技術の実施のための技術的および外科的処置を説明し、洞察を共有し、この実験モデルの適用における重要なステップに関する明確なガイドを提供することを意図している。

プロトコル

ウサギモデルの単離灌流系は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・エンフェルメダーデス・レスピラトリアスの気管支過敏性研究所で広く使用されています。プロトコルは、2.5-3キロのおおよその重量を持つニュージーランドのウサギが含まれています。すべての動物は、標準的なビバリウム条件と実験動物のための公式のメキシコのガイドライン(NOM 062-ZOO-1999)および実験動物のケアと使用のためのガイド(第8版、2011)に従って餌を与えるアドリビタムで保たれました。このプロトコルで提示されたすべての動物の手順と動物のケア方法は、以前にナシオナル・デ・エンフェルメダーデス・レスピラトリアス研究所の倫理委員会によって承認されました。

注:孤立した肺灌流システムの調製には、麻酔下および安楽死による動物の意図的な死が含まれます。

1. 装置および装置の準備。

  1. 機器の配置:
    1. ウサギの重量に応じてサイズの手術台を設定します。
    2. 鋼鉄柱に人工胸郭のカバーを下にガラス室、側面にローラーポンプを備えた人工胸郭のカバーを取り付けます。
    3. カバーが気管に沿って気管カニューレを持つように容易に傾斜して、より速い接続を可能にすることを確認してください。
  2. 人工胸郭:
    メモ:これはシステムの重要な部分です。それは特別なカバーによって密封された水上覆いガラスの部屋から成っている。カバーは、気管と容器を埋め込む接続を持つ臓器ホルダーとして機能します。
    1. 圧縮空気で作動するベンチュリジェットを設置し、人工胸郭内部の負圧を発生させます。
      注:換気制御モジュール(VCM)は、吸気圧と終気流圧の個別の調整、呼吸速度、総サイクル持続時間に対する吸気時間の比率を可能にします。
  3. 装置：
    1. 通常の作業装置は、気胸郭を保持するベースプレートに取り付けられたメインスチールカラムで構成されていることを確認し、気胸計と重量トランスデューサは、その上に位置し、気泡トラップ付きの予熱コイルの後ろに配置します。
    2. 1つの差圧トランスデューサを気胸部に接続し、もう1台をチャンバーの圧力に接続します。胸郭の後ろに圧力トランスデューサの別のカップルを設定し、灌流および静脈圧を測定します。
    3. 酸素供給器の下にある切り替えストックを、レベル電極と装置の横の換気システムに接続します。

2. 心肺ブロックの外科的抽出.

  1. 麻酔：
    1. 鎮静剤(キシラジン)とバルビツール酸塩(ペントバルビタール)の組み合わせを使用します。
      注:異なる麻酔カクテルは、実験的な結果に影響を与えなく使用することができます。
    2. まず、キシラジン塩酸塩(3-5 mg/kg)の単回の筋肉内注射で健康なニュージーランドのウサギを鎮静させます。ウサギが落ち着いてリラックスして、注射の数分後にさらに操作できるようにしてください。
    3. 沈下後、ペントバルビタールナトリウム(28mg/kg)の静脈注射でウサギを麻酔するアクセスとして、限界(横)耳静脈を使用してください。
  2. モニタリング：
    1. 不十分な麻酔や心臓および呼吸機能の過度のうつ病を避けるために、以下のパラメータを監視します。麻酔の深さを評価するには、つま先ピンチテストを行います。
    2. 粘膜がピンクであることを確認します。青または灰色の色合いは低酸素症を示します。
    3. 心拍数が120~135拍/分の間であり、体温が36.5°Cを下回らないようにしてください。
  3. 動物の配置:
    1. ウサギの胴体を剃り、動物を手術台の上に置きます。換気システムをウサギの頭の後ろ側のテーブルの近くに置き、気管切開後すぐにカニューレを接続して、キス状の損傷を避けます。
  4. 切開と気管切開:
    1. 横隔膜から首まで3〜5cmの腹側中央線切開で皮膚を解剖する。
    2. 作動するはさみで、2つの軟骨リングの間の気管の前部2/3を切り、気管線維膜を通して気管カニューレを挿入する。
    3. 5 mm (外径) を挿入します。OD)気管線維膜を通して気管カニューレを、それを注意深く固定するために4-0シルク縫合糸を使用する。
    4. 気管の下に鉗子またはピンセットを置き、カニューレが気管に対して曲がらないようにします。
  5. 陽圧換気:
    1. 肺が人工胸郭の外に残っている限り、手術中の肺の崩壊を避けるために、小さな種の呼吸ポンプを使用して陽圧を換気する。
    2. 気管切開後、胸郭が開く前に、呼吸ポンプに接続された気管カニューレを通して換気を開始します。
    3. 潮の体積を10 mL/kgに設定します。
      注:実験のセットアップと人工胸郭モデルに応じて、負圧を提供するために使用されるのと同じ換気ポンプまたは別の換気ポンプで正圧換気を提供し、迅速な再カニューレーションを可能にします。
  6. 腹間剥離と排泄:
    1. 胸腔にアクセスするには、メスまたはハサミを使用して胸郭壁を開き、胸郭の上3分の1まで内側の切り分けを行います。
    2. 胸郭の半分を2つのレトラクターで開いたままにします。いくつかの肺フラップは通常心臓を取り囲む。
    3. 上司と下の大静脈をローカライズし、糸でそれらを参照してください。
    4. 動物の排泄の前に、右心室を識別し、1000 UI /kgのヘパリンを注入する。
    5. 注射の直後に、前ループの糸で上方と下の静脈を揚げ、排泄を行います。
  7. 心臓肺の収穫:
    1. 心肺ブロックを優しく素早く収穫します。直接デジタル解剖またはスプリングはさみを使用して、胸郭から肺を取り除くように結合組織を分離します。
    2. この地域の血管系と食道を解剖する。
    3. マヌブリウム・シュタルニを切り裂いて気管カニューレに向かって内側の切除術を延長し、両側の気管を組織をつなぐのを離す。
    4. さて、気管カニューレの上の気管を切除します。気管と肺の後部固定が切除されると、カニューレを頭蓋骨軸でそっと引き上げます。
  8. 缶め:
    1. 孤立した肺を胸郭から持ち上げ、シャーレの滅菌ガーゼの上に慎重に置きます。
    2. アテクサシスを防ぐために、2 cmH2Oに設定された正気圧気圧(PEEP)を使用して肺を換気します。
    3. 房室溝のレベルで心臓を切断して心室を取り除きます。
    4. 2つの心室を開けた後、肺動脈を通してバスケットを持つウサギのOD 4.6 mm肺動脈カニューレを導入し、僧帽弁を通してバスケットを通してウサギの5.9mmの左心房を左心房に導入する。
    5. 4-0シルク縫合糸を肺動脈と左心房に使用してカニューレを固定します。これらの構造の崩壊を避けるために、肺動脈と左心房の合字に周囲の組織を含める。
    6. 動脈カニューレを通して生理食前の等張液を250 mL注入し、血管床から残りの血液を洗い流す。

3. 灌流技術。

  1. セットアップ：
    1. 孤立した肺を肺室に慎重に入れます。
    2. チャンバーのカバーのトランスダクタに気管を取り付けます。
    3. カニューレ化された容器を灌流システムに接続します。
    4. チャンバーを閉じて、ロータリーロックで固定します。
      注:再循環灌流回路は、開いた静脈貯留槽、蠕動ポンプ、熱交換器、および気泡トラップで構成されています。
    5. この時点で、チャンバーの蓋を取り付け、栓コックの上に切り替えて、正圧から負圧換気に切り替えます。肺の陰圧換気とチャンバーの気密閉鎖を確認するには、肺の呼吸遠足と圧力計のチャンバー圧力を検査します。
    6. 肺に200 mLの人工血液を含まない透過液(ウシアルブミンの2.5%を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液)を浸透させます。
    7. パーフューズートの流れを3 mL/min/kgで始め、5分の間に5 mL/min/kgまでゆっくりと流れを上げてください。次の5分で8 mL/分/kgの流れに達し、次の5分の期間の後に10 mL /分/kgの最大流量に達する。空気が回路に入らないように注意してください。
      注:pHとパーフューズの温度を生理学的範囲(pH 7.4-7.5;温度、37°C-38°C)内に維持してください。pHを調整するには、NaHCO3(1N)を加えるか、二酸化炭素の流れを増やします。あるいは、HCl(0.1N)を使用して酸性化する。
  2. パラメーター：
    1. 所定の灌流および換気パラメータが必要に応じて設定されているかどうかを確認します。
    2. 30 bpmの頻度で加湿空気、10 mL/kgの潮量、および2 cmH2Oの終気流圧(Pe)で肺を換気する。
      注:肺動脈圧(0-20mmHg)は、肺幹の上のセンチメートルで酸素供給器または貯留槽の液体レベルの高さに対応し、肺静脈圧は左心房の上の圧力平衡槽の高さに対応する。両方の値を変更できます。なお、左心房圧も0~20mmHgである。
  3. ゾーン3条件の達成:
    1. 肺動脈、左心房、および圧力トランスデューサで固定されたカニューレの側のポートに接続された2つのカテーテルを使用して、動脈(Pa)および静脈(Pv)圧力を測定します。
    2. ベースライン圧力を肺のヒラムのレベル(ゼロ参照)に設定します。
    3. ゾーン3の換気条件下で実験を行います。これを達成するために、10〜15分がアイソグラメトリック状態を特徴とする平衡を得るのを待つ。
    4. 静脈圧が肺胞圧(Palv)よりも高く、動脈圧がゾーン3の条件が発生する両方(Pa>Pv>Palv)の両方よりも高いままであることを確認してください。
    5. 肺の体重が一定のままで、動脈および左心房圧が安定してゾーン3の条件を達成し、最大数の肺血管を開放し、実験中に微小血管床の含有量を維持することを確認します。
      注:肺水腫の指標としてのKfcの測定は、手動と自動灌流システムの間に変動はありません。
  4. 電子制御と信号処理:呼吸流れ、体重変化、微小血管圧、潮容容容、血管抵抗、とりわけ、トランスデューサからの信号を統合し、評価システムに表示する複数の中央エレクトロニクスユニットに登録されていることを確認します。

結果

孤立した肺灌流システムは、生検のための臓器操作、灌流からのサンプル収集、および生理学的パラメータのリアルタイムデータ収集を可能にする。分離されたシステムは、代謝および酵素活性から肺移植のための浮腫形成および保存期間に、異なる機能および肺現象を含む多くの仮説をテストするために使用することができる。

図1は、完全に組?...

ディスカッション

この研究は、肺生理学研究に不可欠な技術である孤立した肺灌流システムの一般的なビューを表示する。分離された肺の灌流システムは使用の多様性の大きい程度を提供し、仮説の広い範囲のテストに関連するいくつかの変数の評価を可能にする15。孤立した肺系は、過去10年間に臓器特異的評価との関連性をさらに確立し、間葉系幹細胞16 およびCRISPR/Cas9?...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

著者たちは、この原稿の執筆に対する彼女のサポートに対するベッティーナ・ソマー・セルバンテス博士、イラストによる彼女のサポートに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/WhiteHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilationHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused LungHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powdersigma3912500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.JT Baker10035-04-8
Cryogenic vialsCorning4306592 mL
D-glucosa, C6H12O6.sigmaG5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE ConnectorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE ConnectorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC gradeCaledon
Falcon tubes14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)Hugo Sachs Elektronik (HSE)70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow rangeHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 HzHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9703
HeparinPISA5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)Alltech98121213150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe FilterMillexSLLGR04NL4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 VHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 LHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°CHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS ModuleHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2OJT Baker10034-99-8
Microcentrifuge TubeCorning430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)PISAQ-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter ModuleHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure RegulatorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1755
Potassium chloride, KCl.JT Baker3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4JT Baker7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)PISAQ-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCPHugo Sachs Elektronik (HSE)73-2806
Snap Cap Microcentrifuge TubeCostar36201.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3sigmaS6014
Sodium chloride, NaCl.sigmaS9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubesMasterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4163

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