Sistema de Perfusão pulmonar isolado no modelo coelho

Resumo

A preparação isolada do pulmão do coelho é uma ferramenta padrão-ouro na pesquisa pulmonar. Esta publicação tem como objetivo descrever a técnica desenvolvida para o estudo de mecanismos fisiológicos e patológicos envolvidos na reatividade das vias aéreas, preservação pulmonar e pesquisa pré-plínica em transplante de pulmão e edema pulmonar.

Resumo

O sistema isolado de perfusão pulmonar tem sido amplamente utilizado em pesquisas pulmonares, contribuindo para elucidar o funcionamento interno dos pulmões, tanto micro quanto macroscopicamente. Esta técnica é útil na caracterização da fisiologia pulmonar e patologia medindo atividades metabólicas e funções respiratórias, incluindo interações entre substâncias circulatórias e os efeitos de substâncias inaladas ou perfumadas, como no teste de drogas. Enquanto os métodos in vitro envolvem o corte e a colheita de tecidos, o sistema isolado de perfusão pulmonar ex vivo permite trabalhar com um órgão funcional completo possibilitando o estudo de uma função fisiológica contínua ao mesmo tempo em que recria ventilação e perfusão. No entanto, deve-se notar que os efeitos da ausência de inervação central e drenagem linfática ainda devem ser totalmente avaliados. Este protocolo tem como objetivo descrever a montagem do aparelho pulmonar isolado, seguido da extração cirúrgica e cannulação de pulmões e coração de animais de laboratório experimentais, bem como exibir a técnica de perfusão e processamento de sinais dos dados. A viabilidade média do pulmão isolado varia entre 5-8 h; durante esse período, a permeabilidade capilar pulmonar aumenta, causando edema e lesão pulmonar. A funcionalidade do tecido pulmonar preservado é medida pelo coeficiente de filtragem capilar (Kfc), usado para determinar a extensão do edema pulmonar ao longo do tempo.

Introdução

Brodie e Dixon descreveram pela primeira vez o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo em 1903 ¹. Desde então, tornou-se uma ferramenta padrão-ouro para estudar a fisiologia, farmacologia, toxicologia e bioquímica dos ^pulmões2,3. A técnica oferece uma forma consistente e reprodutível de avaliar a viabilidade dos transplantes de pulmão, e determinar o efeito de mediadores inflamatórios como histamina, metabólitos ácido aracidônico e substância P, entre outros, bem como suas interações durante fenômenos pulmonares como broncoconstrição, atelectasia e edema pulmonar. O sistema pulmonar isolado tem sido uma técnica fundamental para desvendar o importante papel dos pulmões na eliminação de aminas biogênicas de circulação ^geral4,5. Além disso, o sistema tem sido utilizado para avaliar a bioquímica do surfactante ^pulmonar6. Nas últimas décadas, o sistema de perfusão de pulmão ex-vivo tornou-se uma plataforma ideal para pesquisas de transplante de ^pulmão7. Em 2001, uma equipe liderada por Stig Steen descreveu a primeira aplicação clínica do sistema de perfusão pulmonar ex-vivo, usando-o para recondicionar os pulmões de um doador de 19 anos, que foi inicialmente rejeitado pelos centros de transplante devido às suas lesões. O pulmão esquerdo foi colhido e perfundido por 65 min; depois, foi transplantado com sucesso em um homem de 70 anos com ^DPOC8. Outras pesquisas sobre o recondicionamento pulmonar usando a perfusão ex-vivo levaram ao desenvolvimento da técnica de Toronto para perfusão pulmonar prolongada para avaliar e tratar os pulmões doados ^feridos9,10. Clinicamente, o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo tem se mostrado uma estratégia segura para aumentar as piscinas de doadores, tratando e recondicionando pulmões doadores abaixo do padrão, não apresentando diferença significativa de riscos ou desfechos em relação aos doadores de critérios ^padrão10.

A principal vantagem do sistema isolado de perfusão pulmonar é que os parâmetros experimentais podem ser avaliados em um órgão funcional completo que preserva sua função fisiológica sob uma configuração artificial de laboratório. Além disso, permite medir e manipular a ventilação mecânica pulmonar para analisar os componentes da fisiologia pulmonar, como resistência às vias aéreas, resistência vascular total, troca de gás e formação de edema, que até o momento não podem ser medidos precisamente em animais de ^{laboratório2}. Notavelmente, a composição da solução com a qual o pulmão é perfusado pode ser totalmente controlada, permitindo a adição de substâncias para avaliar seus efeitos em tempo real e coleta amostral de perfusão para posterior ^estudo11. Os pesquisadores que trabalham com o sistema pulmonar isolado devem ter em mente que a ventilação mecânica causa decomposição do tecido pulmonar encurtando seu tempo útil. Esta queda progressiva nos parâmetros mecânicos pode ser significativamente retardada por hiperinflar os pulmões ocasionalmente durante o tempo do ^experimento4. Ainda assim, a preparação geralmente não pode durar mais de oito horas. Outra consideração para o sistema de perfusão pulmonar ex-vivo é a ausência de regulação nervosa central e drenagem linfática. Os efeitos de sua ausência ainda não são totalmente compreendidos e poderiam potencialmente ser uma fonte de viés em certos experimentos.

A técnica isolada do sistema de perfusão pulmonar pode ser realizada no modelo coelho com alto grau de consistência e reprodutibilidade. Este trabalho descreve os procedimentos técnicos e cirúrgicos para a implementação da técnica de perfusão pulmonar isolada ex-vivo , desenvolvida para o modelo coelho no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, na Cidade do México, com a intenção de compartilhar os insights e fornecer um guia claro sobre os passos-chave na aplicação desse modelo experimental.

Protocolo

O sistema isolado de perfusão no modelo coelho tem sido amplamente utilizado no Laboratório de Hiperresponsividade Brônquica no Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. O protocolo inclui coelhos neozelandeses com um peso aproximado de 2,5-3 kg. Todos os animais foram mantidos em condições padrão de vivarium e alimentação ad libitum em conformidade com as diretrizes oficiais mexicanas para animais de laboratório (NOM 062-ZOO-1999) e sob o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (^8ª edição, 2011). Todos os procedimentos de animais e métodos de cuidado animal apresentados neste protocolo foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

NOTA: A preparação do sistema isolado de perfusão pulmonar envolve a morte deliberada de um animal sob anestesia e via eutanásia.

1. Equipamento e preparação de aparelhos.

1. Arranjo do equipamento:
   1. Configure uma mesa de operação com tamanho de acordo com o peso do coelho.
   2. Monte a tampa do tórax artificial na coluna de aço com a câmara de vidro por baixo e o ventilador com uma bomba de rolo pelos lados.
   3. Certifique-se de que a tampa está facilmente inclinada a ter a cânula traqueal em linha com a traqueia para permitir uma conexão mais rápida.
2. Tórax artificial:
   NOTA: É uma parte essencial do sistema. Consiste em uma câmara de vidro revesida de água selada por uma capa especial. A tampa funciona como o porta-órgãos com as conexões para cannular a traqueia e os vasos embutidos nela.
   1. Configure um jato venturi operado por ar comprimido para gerar a pressão negativa dentro do tórax artificial.
      NOTA: O módulo de controle de ventilação (VCM) permite ajustes separados de pressões inspiratórias e expiratórias finais, bem como taxa de respiração e a razão de duração inspiratória à duração total do ciclo.
3. Aparelho:
   1. Certifique-se de que um aparelho normalmente funcionando consiste em uma coluna de aço principal montada em uma placa base segurando o tórax artificial, com o pneumotachômetro e transdutor de peso localizado acima dele e atrás da bobina pré-aquecimento com uma armadilha de bolhas.
   2. Conecte um transdutor de pressão diferencial ao pneumotámetro e outro à pressão da câmara. Coloque um par diferente de transdutores de pressão atrás do tórax para medir a perfusão e pressões venosas.
   3. Conecte o estoque de troca abaixo do oxigenador com um eletrodo de nível e o sistema de ventilação ao lado do aparelho.

2. Extração cirúrgica do bloco cardiopulmonar.

1. Anestesia:
   1. Use uma combinação de um sedativo (xilazine) e um barbiturato (pentobarbital).
      NOTA: Diferentes coquetéis anestésicos podem ser usados sem efeito em desfechos experimentais.
   2. Primeiro, sedeia os coelhos saudáveis da Nova Zelândia com uma única injeção intramuscular de cloridrato de xilazina (3-5 mg/kg). Certifique-se de que os coelhos permaneçam calmos e relaxados para permitir mais manipulação após alguns minutos da injeção.
   3. Após a sedação, utilize as veias auditivas marginais (laterais) como acesso à anestesia dos coelhos com uma injeção intravenosa de sódio pentobarbital (28 mg/kg).
2. Monitorização:
   1. Para evitar anestesia insuficiente ou depressão excessiva das funções cardíacas e respiratórias, monitore os seguintes parâmetros. Para avaliar a profundidade da anestesia, realize um teste de beliscão do dedo do dedo do dedo.
   2. Certifique-se de que a membrana mucosa é rosa. Tons azuis ou cinzentos indicam hipóxia.
   3. Certifique-se de que a frequência cardíaca está entre 120-135 batidas/min, e que a temperatura corporal não caia abaixo de 36,5 °C.
3. Colocação animal:
   1. Raspe o tronco do coelho e coloque o animal na mesa de operação em posição supina. Coloque o sistema de ventilação perto da mesa, atrás da cabeça do coelho, para permitir conectar a cânula rapidamente após a traqueotomia para evitar danos tissulares.
4. Incisão e traqueotomia:
   1. Disseca a pele com uma incisão de linha mediana ventral de 3-5 cm do diafragma até o pescoço.
   2. Com a tesoura de operação, corte o 2/3 anterior da traqueia entre dois anéis de cartilagem para inserir a cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal.
   3. Inserir um 5 mm (diâmetro externo; OD) cânula traqueal através da membrana fibrosa traqueal e use uma sutura de seda 4-0 para corrigi-la cuidadosamente.
   4. Coloque as pinças ou pinças debaixo da traqueia para garantir que a cânula não se dobre contra a traqueia.
5. Ventilação de pressão positiva:
   1. Enquanto os pulmões permanecerem fora do tórax artificial, use uma bomba de respiração de pequenas espécies para ventilar uma pressão positiva, a fim de evitar o colapso pulmonar durante a cirurgia.
   2. Inicie a ventilação através da cânula traqueal conectada à bomba de respiração rapidamente após a traqueotomia e antes que o tórax seja aberto.
   3. Ajuste o volume da maré em 10 mL/kg.
      NOTA: Dependendo da configuração do experimento e do modelo de tórax artificial, forneça ventilação de pressão positiva pela mesma bomba de ventilação usada para fornecer pressão negativa ou outra, concedendo uma rápida relaculação.
6. Toracotomia e exsanguinação:
   1. Para acessar a cavidade torácica, use um bisturi ou uma tesoura para abrir a parede do tórax e realizar uma esternotomia medial até o terço superior do tórax.
   2. Mantenha as metades do tórax abertas por dois retratores. Vários retalhos pulmonares geralmente cercam o coração.
   3. Localize a veia cava superior e inferior e encaminhe-as com roscas.
   4. Antes da exsanguinação do animal, identifique o ventrículo direito e injete 1000 UI/kg de heparina.
   5. Imediatamente após a injeção, ligar a veia cava superior e inferior com o fio pré-looped e realizar a exsanguinação.
7. Colheita coração-pulmão:
   1. Colher o bloco cardiopulmonar suavemente e rapidamente. Use dissecção digital direta ou tesoura de mola para separar o tecido conjuntivo de modo a remover os pulmões do tórax.
   2. Dissecar a vasculatura na área, bem como o esôfago.
   3. Corte o manúbrio sterni para estender a esternotomia medial em direção à cânula traqueal, liberando a traqueia em ambos os lados de tecido de conexão.
   4. Agora, ressegue a traqueia acima da cânula traqueal. Puxe suavemente a cânula em um eixo craniocaudal à medida que a fixação dorsal da traqueia e pulmões é ressecada.
8. Canulação:
   1. Levante os pulmões isolados do tórax e coloque-os cuidadosamente sobre uma gaze estéril em uma placa de petri.
   2. Para evitar atelectasia, ventile os pulmões usando ventilação de pressão positiva com pressão final positiva (PEEP) fixada em 2 _cmH2O.
   3. Remova os ventrículos cortando-os do coração ao nível da ranhura atrioventricular.
   4. Depois de abrir os dois ventrículos, introduza a cânula da artéria pulmonar OD de 4,6 mm para o coelho com uma cesta através da artéria pulmonar e introduza a cânula de átrio esquerdo de 5,9 mm para o coelho com a cesta através da válvula mitral no átrio esquerdo.
   5. Use uma sutura de seda 4-0 na artéria pulmonar e átrio esquerdo para consertar as cânulas. Inclua os tecidos circundantes nas ligaduras da artéria pulmonar e átrio esquerdo para evitar a distensão dessas estruturas.
   6. Injete 250 mL de solução isotônica salina através da cânula arterial para retirar o sangue restante do leito vascular.

3. Técnica de perfusão.

1. Configuração:
   1. Coloque os pulmões isolados cuidadosamente na câmara pulmonar.
   2. Coloque a traqueia no transdutor na tampa da câmara.
   3. Conecte as naves cânuladas ao sistema de perfusão.
   4. Feche a câmara e fixe-a com a fechadura rotativa.
      NOTA: O circuito de perfusão recirculante consiste em um reservatório venoso aberto, uma bomba peristáltica, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas.
   5. Neste ponto, conecte a tampa da câmara e troque sobre uma torneira para mudar de ventilação de pressão positiva para negativa. Para verificar a ventilação de pressão negativa dos pulmões e o fechamento hermético da câmara, inspecione a excursão respiratória da pressão pulmonar e de câmara no medidor de pressão.
   6. Perfuuse os pulmões com 200 mL de perfusato artificial sem sangue (um tampão bicarbonato Krebs-Ringer contendo 2,5% de albumina bovina).
   7. Inicie o fluxo de perfusato a 3 mL/min/kg, em seguida, intensifique lentamente o fluxo durante um período de 5 minutos para 5 mL/min/kg. Atinja um fluxo de 8 mL/min/kg ao longo dos próximos 5 minutos e, em seguida, após outro período de 5 min, atinja um fluxo máximo de 10 mL/min/kg. Tome cuidado para evitar que o ar entre no circuito.
      NOTA: Mantenha o pH e a temperatura do perfusato dentro das faixas fisiológicas (pH 7.4-7.5; temperatura, 37 °C-38 °C). Para ajustar o pH, adicione _NaHCO3 (1N) ou aumente o fluxo de dióxido de carbono. Alternativamente, use HCl (0.1N) para acidificar.
2. Parâmetros:
   1. Verifique se os parâmetros de perfusão e ventilação predeterminados estão definidos conforme necessário.
   2. Ventilar os pulmões com ar umidificado a uma frequência de 30 bpm, um volume de maré de 10 mL/kg, e uma pressão expiratória final (Pe) de 2 _cmH2O.
      NOTA: A pressão arterial pulmonar (0-20 mmHg) corresponde à altura do nível líquido no oxigenador ou reservatório em centímetros acima do tronco pulmonar, enquanto a pressão venosa pulmonar corresponde à altura da câmara de equilíbrio de pressão acima do átrio esquerdo. Ambos os valores podem ser modificados. Note que a pressão do átrio esquerdo também é de 0-20 mmHg.
3. Alcançar condições da zona 3:
   1. Use os dois cateteres conectados às portas laterais do cânulas fixados na artéria pulmonar, átrio esquerdo e transdutores de pressão para medir as pressões arterial (Pa) e venosa (Pv).
   2. Coloque as pressões da linha de base no nível do hilum pulmonar (referência zero).
   3. Conduzir os experimentos sob condições de ventilação da zona 3. Para isso, espere de 10 a 15 min para obter um equilíbrio caracterizado por um estado isogravimétrico.
   4. Certifique-se de que a pressão venosa é maior do que a pressão alveolar (Palv) e que a pressão arterial permaneça maior do que ambas (Pa > Pv > Palv) para que as condições da Zona 3 ocorram.
   5. Certifique-se de que o peso dos pulmões permaneça constante e as pressões atrial arterial e esquerda são estáveis para alcançar condições da zona 3 para abrir um número máximo de vasos pulmonares e manter o teor de leito microvascular durante o experimento.
      NOTA: A medição do Kfc como indicador de edema pulmonar não tem variação entre um sistema manual e de perfusão automática.
4. Controle eletrônico e processamento de sinais: Certifique-se de que o fluxo respiratório, as alterações de peso, a pressão microvascular, o volume da maré, a resistência vascular, entre outros, sejam registrados em uma unidade eletrônica central múltipla que integra sinais provenientes dos transdutores e os exibe no sistema de avaliação.

Resultados

O sistema isolado de perfusão pulmonar permite manipulação de órgãos para biópsia, coleta de amostras de perfusão e coleta de dados em tempo real de parâmetros fisiológicos. O sistema isolado pode ser usado para testar muitas hipóteses envolvendo diferentes funções e fenômenos pulmonares, desde atividade metabólica e enzimática até períodos de formação e preservação de edema para transplantes de pulmão.

A Figura 1 exibe um diagrama do sistema...

Discussão

Este trabalho apresenta uma visão geral do sistema isolado de perfusão pulmonar, uma técnica essencial na pesquisa de fisiologia pulmonar. O sistema isolado de perfusão pulmonar oferece um grande grau de versatilidade em seus usos e permite a avaliação de vários parâmetros relevantes no teste de uma ampla gama de ^hipóteses15. Um sistema pulmonar isolado é uma ferramenta com presença mundial que, na última década, estabeleceu ainda mais sua relevância para avaliações específicas de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder	sigma	3912	500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Cryogenic vials	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade	Caledon
Falcon tubes			14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	PISA		5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Microcentrifuge Tube	Corning	430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potassium chloride, KCl.	JT Baker	3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)	PISA	Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube	Costar	3620	1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3	sigma	S6014
Sodium chloride, NaCl.	sigma	S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes	Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163