Изолированная система перфузии легких в модели кролика

Резюме

Изолированный препарат для легких кролика является золотым стандартом в исследованиях легких. Эта публикация направлена на описание методики, разработанной для изучения физиологических и патологических механизмов, участвующих в реактивности дыхательных путей, сохранении легких и доклинических исследованиях при трансплантации легких и отеке легких.

Аннотация

Изолированная система перфузии легких широко используется в легочных исследованиях, способствуя выяснению внутренней работы легких, как микро- и макроскопически. Этот метод полезен при характеристике физиологии и патологии легких путем измерения метаболической активности и дыхательных функций, включая взаимодействия между циркулирующими веществами и эффекты вдыхаемых или перфузированных веществ, как при тестировании на наркотики. В то время как методы in vitro включают нарезку и культивирование тканей, изолированная система перфузии легких ex vivo позволяет работать с полным функциональным органом, что делает возможным изучение непрерывной физиологической функции при воссоздании вентиляции и перфузии. Однако следует отметить, что последствия отсутствия центральной иннервации и лимфодренажа еще предстоит полностью оценить. Этот протокол направлен на описание сборки изолированного аппарата легких с последующим хирургическим извлечением и канюляцией легких и сердца у экспериментальных лабораторных животных, а также на отображение метода перфузии и обработки сигналов данных. Средняя жизнеспособность изолированного легкого колеблется в пределах 5-8 ч; в этот период повышается проницаемость легочных капилляров, вызывая отек и травмирование легких. Функциональность сохраненной легочной ткани измеряется коэффициентом капиллярной фильтрации (Kfc), используемым для определения степени отека легких во времени.

Введение

Броди и Диксон впервые описали систему перфузии легких ex-vivo в 1903 ^{году 1}. С тех пор он стал золотым стандартом для изучения физиологии, фармакологии, токсикологии и биохимии ^{легких2,3}. Метод предлагает последовательный и воспроизводимый способ оценки жизнеспособности трансплантации легких и определения эффекта воспалительных медиаторов, таких как гистамин, метаболиты арахидоновой кислоты и вещество P, среди прочих, а также их взаимодействия во время легочных явлений, таких как бронхоконстрикция, ателектаз и отек легких. Изолированная система легких была ключевым методом в раскрытии важной роли легких в устранении биогенных аминов из общего ^{кровообращения4,5}. Кроме того, система была использована для оценки биохимии легочного поверхностно-активного ^{вещества6}. За последние несколько десятилетий система перфузии легких ex-vivo стала идеальной платформой для исследований трансплантации ^{легких7}. В 2001 году команда во главе со Стигом Стином описала первое клиническое применение системы перфузии легких ex-vivo, используя ее для восстановления легких 19-летнего донора, который был первоначально отвергнут центрами трансплантации из-за его травм. Левое легкое собирали и перфузировали в течение 65 мин; после этого он был успешно пересажен 70-летнему мужчине с ^ХОБЛ8. Дальнейшие исследования по восстановлению легких с использованием перфузии ex-vivo привели к разработке метода Торонто для расширенной перфузии легких для оценки и лечения поврежденных донорских ^{легких9,10}. Клинически система перфузии легких ex-vivo показала, что является безопасной стратегией увеличения донорских пулов путем лечения и восстановления нестандартных донорских легких, не представляя существенной разницы в рисках или исходах по сравнению со стандартными критериями ^{доноров10}.

Основным преимуществом изолированной системы перфузии легких является то, что экспериментальные параметры могут быть оценены в полном функциональном органе, который сохраняет свою физиологическую функцию при искусственной лабораторной установке. Кроме того, он позволяет измерять и манипулировать легочной механической вентиляцией для анализа компонентов легочной физиологии, таких как сопротивление дыхательных путей, общее сосудистое сопротивление, газообмен и образование отеков, которые на сегодняшний день не могут быть измерены точно in vivo на лабораторных ^{животных2}. Примечательно, что состав раствора, с помощью которого перфузируется легкое, можно полностью контролировать, что позволяет добавлять вещества для оценки их воздействия в режиме реального времени и сбора проб из перфузии для дальнейшего ^{изучения11}. Исследователи, работающие с изолированной системой легких, должны иметь в виду, что механическая вентиляция вызывает распад легочной ткани, сокращая ее полезное время. Это прогрессирующее падение механических параметров может быть значительно замедлено гиперинфляцией легких время от времени во время ^{эксперимента4}. Тем не менее, подготовка обычно не может длиться более восьми часов. Другим соображением для системы перфузии легких ex-vivo является отсутствие центральной нервной регуляции и лимфодренажа. Последствия их отсутствия еще не полностью поняты и потенциально могут быть источником предвзятости в некоторых экспериментах.

Метод изолированной перфузионной системы легких может быть выполнен в модели кролика с высокой степенью консистенции и воспроизводимости. В этой работе описываются технические и хирургические процедуры для реализации метода изолированной перфузии легких ex-vivo , разработанного для модели кролика в Национальном институте респираторных заболеваний в Мехико, с намерением поделиться идеями и предоставить четкое руководство по ключевым шагам в применении этой экспериментальной модели.

протокол

Изолированная перфузионная система в модели кролика широко используется в лаборатории бронхиальной гиперчувствительности в Национальном институте респираторных заболеваний. Протокол включает новозеландских кроликов с примерным весом 2,5-3 кг. Все животные содержались в стандартных условиях вивария и кормлении ad libitum в соответствии с официальными мексиканскими руководящими принципами для лабораторных животных (NOM 062-ZOO-1999) и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (^8-е издание, 2011). Все процедуры для животных и методы ухода за животными, представленные в этом протоколе, были предварительно одобрены Комитетом по этике Национального института респираторных заболеваний.

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка изолированной системы перфузии легких включает в себя преднамеренную смерть животного под наркозом и путем эвтаназии.

1. Оборудование и подготовка аппаратуры.

1. Компоновка оборудования:
   1. Установите операционный стол с размером в соответствии с весом кролика.
   2. Установите крышку искусственной грудной клетки на стальную колонну со стеклянной камерой внизу и вентилятор с роликовым насосом по бокам.
   3. Убедитесь, что крышка легко наклонена к тому, чтобы канюля трахеи была на одной линии с трахеей, чтобы обеспечить более быстрое соединение.
2. Искусственная грудная клетка:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это неотъемлемая часть системы. Он состоит из стеклянной камеры с водяной рубашкой, герметичной специальной крышкой. Крышка работает как органодержатель с соединениями для канюляции трахеи и сосудов, встроенных в нее.
   1. Настройте струю Вентури, управляемую сжатым воздухом, для создания отрицательного давления внутри искусственной грудной клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль управления вентиляцией (VCM) позволяет отдельно регулировать давление вдоха и на конце выдоха, а также скорость дыхания и отношение продолжительности вдоха к общей продолжительности цикла.
3. Аппарат:
   1. Убедитесь, что нормально работающий аппарат состоит из основной стальной колонны, установленной на опорной пластине, удерживающей искусственную грудную клетку, с пневмотахометром и датчиком веса, расположенными над ним и за катушкой предварительного нагрева с пузырьковой ловушкой.
   2. Подключите один преобразователь дифференциального давления к пневмотахометру, а другой к давлению в камере. Установите другую пару датчиков давления за грудной клеткой для измерения перфузии и венозного давления.
   3. Подключите переходный материал под кислородным оксигенатором с нивелиром и системой вентиляции рядом с аппаратом.

2. Хирургическое извлечение сердечно-легочного блока.

1. Анестезия:
   1. Используйте комбинацию седативного средства (ксилазин) и барбитурата (пентобарбитала).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные обезболивающие коктейли могут быть использованы без влияния на результаты экспериментов.
   2. Во-первых, успокоить здоровых новозеландских кроликов однократной внутримышечной инъекцией ксилазина гидрохлорида (3-5 мг/кг). Убедитесь, что кролики остаются спокойными и расслабленными, чтобы позволить дальнейшие манипуляции после нескольких минут инъекции.
   3. После седации используют маргинальные (боковые) ушные вены в качестве доступа для обезболивания кроликов внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия (28 мг/кг).
2. Контроль:
   1. Чтобы избежать недостаточной анестезии или чрезмерного угнетения сердечной и дыхательной функций, контролируйте следующие параметры. Чтобы оценить глубину анестезии, выполните тест на ущемление пальца ноги.
   2. Убедитесь, что слизистая оболочка розовая. Синие или серые оттенки указывают на гипоксию.
   3. Убедитесь, что частота сердечных сокращений составляет 120-135 ударов в минуту, и что температура тела не опускается ниже 36,5 ° C.
3. Размещение животных:
   1. Побрейте туловище кролика и положите животное на операционный стол в лежачем положении. Поместите вентиляционную систему рядом со столом, за головой кролика, чтобы обеспечить быстрое соединение канюль после трахеотомии, чтобы избежать повреждения тиссуляра.
4. Разрез и трахеотомия:
   1. Рассекните кожу вентральным срединным разрезом 3-5 см от диафрагмы до шеи.
   2. С помощью операционных ножниц разрезайте переднюю 2/3 трахеи между двумя хрящевыми кольцами, чтобы вставить канюлю трахеи через фиброзную оболочку трахеи.
   3. Вставьте 5 мм (наружный диаметр; OD) канюля трахеи через фиброзную оболочку трахеи и использовать 4-0 шелковый шов, чтобы аккуратно зафиксировать его.
   4. Поместите щипцы или пинцет под трахею, чтобы канюля не сгибалась против трахеи.
5. Вентиляция под положительным давлением:
   1. Пока легкие остаются вне искусственной грудной клетки, используйте дыхательный насос небольшого вида для вентиляции положительного давления, чтобы избежать коллапса легких во время операции.
   2. Инициируйте вентиляцию через канюлю трахеи, подключенную к дыхательному насосу, быстро после трахеотомии и до открытия грудной клетки.
   3. Установите дыхательный объем на уровне 10 мл/кг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от установки эксперимента и модели искусственной грудной клетки обеспечьте вентиляцию под положительным давлением либо с помощью того же вентиляционного насоса, который используется для обеспечения отрицательного давления, либо с помощью другого, что обеспечивает быстрое повторное канюляцию.
6. Торакотомия и экссангинация:
   1. Чтобы получить доступ к грудной полости, используйте скальпель или ножницы, чтобы открыть стенку грудной клетки и выполнить медиальную стернотомию до верхней трети грудной клетки.
   2. Держите половинки грудной клетки открытыми двумя втягивающими устройствами. Несколько легочных лоскутов обычно окружают сердце.
   3. Локализуйте верхнюю и нижнюю полую вену и направляйте их нитями.
   4. Перед экссангинацией животного определите правый желудочек и введите 1000 UI/кг гепарина.
   5. Сразу после инъекции обжаривают верхнюю и нижнюю полую вену предварительно закольцованной нитью и выполняют экссангинацию.
7. Урожай сердца и легких:
   1. Соберите сердечно-легочный блок аккуратно и быстро. Используйте прямое цифровое рассечение или пружинные ножницы, чтобы отделить соединительную ткань, чтобы удалить легкие из грудной клетки.
   2. Рассекайте сосудистую систему в этой области, а также пищевод.
   3. Прорежьте manubrium sterni, чтобы расширить медиальную стернотомию к канюле трахеи, освобождая трахею с обеих сторон от соединительной ткани.
   4. Теперь резекция трахеи над канюлей трахеи. Осторожно подтяните канюлю по краниокаудальной оси, так как дорсальная фиксация трахеи и легких резецируется.
8. Каннуляция:
   1. Выньте изолированные легкие из грудной клетки и осторожно поместите их поверх стерильной марли на чашке Петри.
   2. Для предотвращения ателектаза проветривайте легкие с помощью вентиляции с положительным давлением с положительным давлением выдоха (PEEP), установленным на уровне 2 _смH2O.
   3. Удалите желудочки, отрезав им сердце на уровне атриовентрикулярной бороздки.
   4. После вскрытия двух желудочков вводят канюлю легочной артерии OD 4,6 мм для кролика с корзиной через легочную артерию и вводят канюлю OD 5,9 мм левого предсердия для кролика с корзиной через митральный клапан в левое предсердие.
   5. Используйте шелковый шов 4-0 в легочной артерии и левом предсердии, чтобы зафиксировать канюли. Включите окружающие ткани в лигатуры легочной артерии и левого предсердия, чтобы избежать растяжения этих структур.
   6. Вводят 250 мл физиологического изотонического раствора через артериальные канюли, чтобы промыть оставшуюся кровь из сосудистого русла.

3. Перфузионная техника.

1. Настройка:
   1. Осторожно поместите изолированные легкие в камеру легких.
   2. Прикрепите трахею к трансдуктору на крышке камеры.
   3. Подключите канюлированные сосуды к перфузионной системе.
   4. Закройте камеру и закрепите ее поворотным замком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рециркуляционный перфузионный контур состоит из открытого венозного резервуара, перистальтического насоса, теплообменника и пузырьковой ловушки.
   5. В этот момент прикрепите крышку камеры и переключите запорный кран, чтобы переключиться с вентиляции с положительным на отрицательное давление. Чтобы проверить вентиляцию легких при отрицательном давлении и герметичное закрытие камеры, осмотрите дыхательную экскурсию легкого и давление в камере на манометре.
   6. Перфузируйте легкие 200 мл искусственного перфузата без крови (бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий 2,5% бычьего альбумина).
   7. Начните поток перфусата со скоростью 3 мл/мин/кг, затем медленно увеличьте расход в течение 5-минутного периода до 5 мл/мин/кг. Достигните расхода 8 мл/мин/кг в течение следующих 5 мин, а затем через еще 5 мин достигайте максимального потока 10 мл/мин/кг. Позаботьтесь о том, чтобы воздух не попадал в цепь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать рН и температуру перфусата в физиологических диапазонах (рН 7,4-7,5; температура, 37 °C-38 °C). Чтобы отрегулировать pH, добавьте _NaHCO3 (1N) или увеличьте поток углекислого газа. В качестве альтернативы, используйте HCl (0,1N) для подкисления.
2. Параметры:
   1. Проверьте, установлены ли заданные параметры перфузии и вентиляции по мере необходимости.
   2. Проветривайте легкие увлажненным воздухом с частотой 30 уд/мин, приливным объемом 10 мл/кг и давлением в конце выдоха (Pe) 2 _смH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Легочное артериальное давление (0-20 мм рт.ст.) соответствует высоте уровня жидкости в оксигенаторе или резервуаре в сантиметрах над легочным стволом, в то время как легочное венозное давление соответствует высоте камеры равновесия давления над левым предсердием. Оба значения могут быть изменены. Отметим, что давление в левом предсердии также составляет 0-20 мм рт.ст.
3. Достижение условий зоны 3:
   1. Используйте два катетера, соединенных с боковыми портами канюль, закрепленных в легочной артерии, левом предсердии, и датчиками давления для измерения артериального (Pa) и венозного (Pv) давления.
   2. Установите базовое давление на уровне легкого хилума (Zero-reference).
   3. Проводить эксперименты в условиях вентиляции зоны 3. Для этого подождите 10-15 мин, чтобы получить равновесие, характеризующееся изогравиметрическим состоянием.
   4. Убедитесь, что венозное давление выше, чем альвеолярное давление (Palv), а артериальное давление остается выше, чем оба (Pa > Pv > Palv) для возникновения условий зоны 3.
   5. Убедитесь, что вес легких остается постоянным, а артериальное и левое предсердное давления стабильны для достижения условий зоны 3 для открытия максимального количества легочных сосудов и поддержания содержания микрососудистого русла во время эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение Kfc как показателя отека легких не имеет различий между ручной и автоматической перфузионной системой.
4. Электронное управление и обработка сигналов: Убедитесь, что дыхательный поток, изменения веса, микрососудистое давление, приливный объем, сосудистое сопротивление, среди прочего, зарегистрированы на нескольких центральных электронных устройствах, которые интегрируют сигналы, поступающие от преобразователей, и отображают их в системе оценки.

Результаты

Изолированная система перфузии легких позволяет манипулировать органами для биопсии, сбора образцов из перфузии и сбора физиологических параметров в режиме реального времени. Изолированная система может быть использована для проверки многих гипотез, связанных с различными функциям...

Обсуждение

Эта работа отображает общий взгляд на изолированную систему перфузии легких, необходимую технику в исследованиях физиологии легких. Изолированная система перфузии легких предлагает большую степень универсальности в ее использовании и позволяет оценить несколько параметров, имеющи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder	sigma	3912	500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Cryogenic vials	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade	Caledon
Falcon tubes			14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	PISA		5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Microcentrifuge Tube	Corning	430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potassium chloride, KCl.	JT Baker	3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)	PISA	Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube	Costar	3620	1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3	sigma	S6014
Sodium chloride, NaCl.	sigma	S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes	Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163