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요약

고립 된 토끼 폐 제제는 폐 연구에서 금 표준 도구입니다. 이 간행물은 기도 반응성, 폐 보존 및 폐 이식 및 폐 부종의 전임상 연구에 관여하는 생리적 및 병리학 적 메커니즘의 연구를 위해 개발 된 기술을 설명하는 것을 목표로합니다.

초록

고립 된 폐 관류 시스템은 폐 연구에서 널리 사용되어 미세 및 거시적으로 폐의 내부 작동을 해명하는 데 기여했습니다. 이 기술은 순환 물질 과 흡입 또는 perfused 물질의 효과 사이의 상호 작용을 포함하여 대사 활동 과 호흡 기능을 측정하여 폐 생리학 및 병리학의 특성화에 유용합니다. 시험관 내 방법은 조직의 슬라이스 및 배양을 포함하지만, 고립 된 전 생체 폐 관류 시스템은 환기 및 관류를 재현하면서 지속적인 생리 적 기능의 연구를 가능하게하는 완전한 기능성 기관과 함께 작동 할 수 있습니다. 그러나 중앙 내분과 림프 배수의 부재의 효과는 여전히 완전히 평가되어야한다는 점에 유의해야합니다. 이 프로토콜은 실험 실험실 동물로부터 폐와 심장의 수술 추출 및 캐니언화에 이어 분리된 폐 장치의 조립을 설명하고 데이터의 관류 기술 및 신호 처리를 표시하는 것을 목표로 합니다. 격리된 폐의 평균 생존가능성은 5-8h 사이입니다. 이 기간 동안 폐 모세관 투과성이 증가하여 부종과 폐 손상을 유발합니다. 보존된 폐 조직의 기능은 시간이 지남에 따라 폐 부종의 정도를 결정하는 데 사용되는 모세관 여과 계수(Kfc)에 의해 측정됩니다.

서문

브로디와 딕슨은 1903년 전 생체폐 관류 시스템을 처음 설명했다. 그 이후로 폐의 생리학, 약리학, 독성학 및 생화학을 연구하기위한 금 표준 도구가되었습니다2,3. 이 기술은 폐 이식의 생존가능성을 평가하고 히스타민, 아라키도니아산 대사산물 및 물질 P와 같은 염증 성 중재자의 효과뿐만 아니라 기관지 수축, 천자 수축 및 폐 적 부종과 같은 폐 현상 동안의 상호 작용을 결정하는 일관되고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 고립 된 폐 시스템은 일반 순환에서 생물 발생 아민의 제거에 폐의 중요한 역할을 공개하는 중요한 기술이었다4,5. 또한, 시스템은 폐 계면 활성제6의 생화학을 평가하는 데 사용되었습니다6. 지난 수십 년 동안, 전 생체 폐 관류 시스템은 폐 이식 연구를위한 이상적인 플랫폼이되었다7. 2001년 Stig Steen의 한 팀은 19세 기증자의 폐를 재조정하기 위해 이 시스템을 사용하여 전 생체 폐 관류 시스템의 첫 임상 적용을 설명했는데, 이 기구는 부상으로 인해 이식 센터에 의해 처음 거부되었습니다. 왼쪽 폐는 65분 동안 수확되고 퍼프되었습니다. 그 후, 그것은 성공적으로 COPD8와 70 세의 남자로 이식되었다. 전 생체 내 관류를 사용하여 폐 재조절에 대한 추가 연구는 부상당한 기증자 폐9,10을 평가하고 치료하기 위해 확장 된 폐 관류를위한 토론토 기술을 개발하도록 주도했습니다. 임상적으로, 전 생체 폐 관류 시스템은 표준 기준 기증자10에 대하여 위험 또는 결과에 있는 중요한 다름을 제시하고, 취급하고 표준 표준 기증자 폐를 재조정하여 기증자 풀을 증가하는 안전한 전략인 것을 보여주었습니다.

고립 된 폐 관류 시스템의 주요 장점은 실험 파라미터가 인공 실험실 설정에서 생리 적 기능을 보존하는 완전한 기능성 기관에서 평가 될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 폐 기계 환기의 측정 및 조작을 통해 기도 저항, 총 혈관 저항, 가스 교환 및 부종 형성과 같은 폐 생리학의 구성 요소를 분석할 수 있으며, 이는 현재까지 실험실 동물에 대한 생체 내에서 정확하게 측정할 수 없다2. 특히, 폐가 침투되는 용액의 조성은 완전히 조절될 수 있으며, 추가 연구를 위해 관류로부터 실시간으로 그 효과를 평가하고 샘플 수집을 할 수 있게 한다11. 고립 된 폐 시스템으로 일하는 연구원은 기계적 환기가 폐 조직의 붕괴를 유발하여 유용한 시간을 단축한다는 것을 명심해야합니다. 기계적 파라미터의 이러한 점진적 낙하는 실험4의 시간 동안 때때로 폐를 과열하여 현저하게 지연될 수 있다. 여전히, 준비는 일반적으로 8 시간 이상 지속될 수 없습니다. 전 생체 폐 관류 시스템에 대한 또 다른 고려 사항은 중추 신경계 조절 및 림프 배수의 부재입니다. 그들의 부재의 효력은 아직 완전히 이해되지 않으며 잠재적으로 특정 실험에 있는 편견의 근원이 될 수 있습니다.

고립 된 폐 관류 시스템 기술은 높은 수준의 일관성과 재현성을 가진 토끼 모델에서 수행 될 수있다. 이 작품은 멕시코 시티의 인스티투토 나시오날 드 엔페르메다데스 호흡증에서 토끼 모델을 위해 개발된 전 생체 내 외 외 폐 관류 기술의 구현을 위한 기술적 및 외과 적 절차를 설명하고, 통찰력을 공유하고이 실험 모델의 적용에 중요한 단계에 대한 명확한 가이드를 제공하려고합니다.

프로토콜

토끼 모델의 고립 된 관류 시스템은 Instituto Nacional 드 Enfermedades 호흡증선의 기관지 과잉 반응 연구소에서 널리 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 대략 무게가 2.5-3kg인 뉴질랜드 토끼가 포함됩니다. 모든 동물은 실험실 동물에 대한 공식 멕시코 지침 (NOM 062-ZOO-1999)과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드 (8 판, 2011)에 따라 표준 vivarium 조건 및 광고 리비툼 공급에 보관되었습니다. 이 프로토콜에 제시된 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 이전에 Instituto Nacional 드 Enfermedades Respiratorias의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

참고: 고립된 폐 관류 시스템의 준비는 마취 하에 그리고 안락사를 통해 동물의 의도적인 죽음을 관련시킵니다.

1. 장비 및 장치의 준비.

  1. 장비 배치:
    1. 토끼의 무게에 따라 크기가 있는 수술테이블을 설정합니다.
    2. 강철 기둥에 인공 흉부 덮개를 장착하고 유리 챔버 아래에 유리 챔버와 측면에 롤러 펌프가있는 인공 호흡기를 장착합니다.
    3. 커버가 기관장 캐뉼라를 기관지와 일치시키는 경향이 있어 더 빠른 연결을 가능하게 합니다.
  2. 인공 흉부:
    참고 : 그것은 시스템의 필수적인 부분입니다. 특수 커버로 밀봉된 워터 재킷 유리 챔버로 구성되어 있습니다. 커버는 기관및 혈관을 이식할 수 있는 연결과 함께 장기 홀더로 작동합니다.
    1. 인공 흉부 내부에 음압을 생성하기 위해 압축 공기로 작동하는 벤츄리 제트를 설정합니다.
      참고: 환기 제어 모듈(VCM)은 호흡 률 및 총 사이클 지속 기간에 대한 호흡 률 및 호흡 기간의 비율을 별도로 조정할 수 있습니다.
  3. 기구:
    1. 일반적으로 작동하는 장치는 인공 흉부를 들고 베이스 플레이트에 장착 된 주요 강철 기둥으로 구성되어 있는지 확인하며, 기압 측정기와 무게 트랜스듀서가 그 위와 거품 트랩이있는 예열 코일 뒤에 위치합니다.
    2. 하나의 차동 압력 변환기를 폐렴기계에 연결하고 다른 하나는 챔버 압력에 연결합니다. 관류 및 정맥 압력을 측정하기 위해 흉부 뒤에 다른 압력 변환기를 설정합니다.
    3. 산소 공급장치 아래의 전환 재고를 장치 옆에 있는 레벨 전극 및 환기 시스템과 연결합니다.

2. 심폐 블록의 외과 추출.

  1. 마취:
    1. 진정제 (자일라진)와 바르비투르산염 (펜토바르비탈)의 조합을 사용합니다.
      참고: 다른 마취 칵테일은 실험 결과에 영향을 미치지 않고 사용할 수 있습니다.
    2. 먼저, 건강한 뉴질랜드 토끼를 자일라진 염산염(3-5 mg/kg)의 단일 근육 주사로 진정시킵니다. 토끼가 주입 몇 분 후에 추가 조작을 허용하도록 조용하고 편안한 상태를 유지하십시오.
    3. 다음 체형, 한계 (측면) 귀 정맥을 펜토 바르 비탈 나트륨 (28 mg/kg)의 정맥 주사와 토끼를 마취에 액세스 할 수 있습니다 사용합니다.
  2. 모니터링:
    1. 부족 한 마취 또는 심장 및 호흡 기능의 과도 한 우울증을 방지 하려면 다음 매개 변수를 모니터링. 마취의 깊이를 평가하려면 발가락 핀치 테스트를 수행하십시오.
    2. 점막이 분홍색인지 확인합니다. 파란색 또는 회색 음영은 저산소증을 나타냅니다.
    3. 심박수가 120-135비트/분 사이이고 체온이 36.5°C 이하로 떨어지지 않도록 하십시오.
  3. 동물 배치:
    1. 토끼의 몸통을 면도하고 동물을 수술대에 놓습니다. 통풍 시스템을 테이블 근처에 놓고 토끼의 머리 뒤에, 기관 절제술 후 캐뉼라를 신속하게 연결하여 티슬 손상을 피하십시오.
  4. 절개 및 기관 절제술:
    1. 다이어프램에서 목까지 3-5cm의 복부 중앙분리성 으로 피부를 해부합니다.
    2. 작동 가위를 사용하여 두 연골 고리 사이에 기관지의 전방 2/3을 잘라 기관 섬유 막을 통해 기관 캐뉼라를 삽입합니다.
    3. 5mm(외부 직경)를 삽입합니다. OD) 기관 섬유 막을 통해 기관 캐뉼라를 사용하고 신중하게 해결하기 위해 4-0 실크 봉합사를 사용합니다.
    4. 통관이 기관지에 구부러지지 않도록 집게 또는 핀셋을 기관 아래에 놓습니다.
  5. 양압 환기:
    1. 폐가 인공 흉부 외부에 남아있는 한, 수술 중 폐 붕괴를 방지하기 위해 양압을 환기시키기 위해 작은 종 호흡 펌프를 사용합니다.
    2. 기관 절제술 후 흉부가 열리기 전에 호흡 펌프에 연결된 기관 캐뉼라를 통해 환기를 시작하십시오.
    3. 조력 량을 10mL/kg으로 설정합니다.
      참고: 실험 설정 및 인공 흉부 모델에 따라 음압 또는 다른 환기 를 제공하는 데 사용되는 동일한 환기 펌프로 양압 환기를 제공하여 빠른 재캐닝을 제공합니다.
  6. 소라코토미와 신전:
    1. 흉부 구멍에 액세스하려면 메스 또는 가위를 사용하여 흉부 벽을 열고 흉부의 상위 3 분의 1까지 내측 스분루를 수행하십시오.
    2. 두 개의 리트랙터에 의해 열 흉부 반쪽을 잡아. 몇몇 폐 플랩은 일반적으로 심혼을 포위합니다.
    3. 우수하고 열등한 베나 카바를 현지화하고 실로 참조하십시오.
    4. 동물의 멸종 전에, 오른쪽 심실을 식별하고 헤파린의 1000 UI / kg을 주입.
    5. 주입 직후, 사전 루프 스레드로 우수하고 열등한 베나 카바를 리게이트하고 exsanguination을 수행합니다.
  7. 심장 폐 수확:
    1. 심폐 블록을 부드럽고 빠르게 수확하십시오. 흉부에서 폐를 제거하기 위해 결합 조직을 분리하기 위해 직접 디지털 해부 또는 스프링 가위를 사용합니다.
    2. 식도뿐만 아니라 이 지역의 혈관을 해부합니다.
    3. 관내 스테미를 잘라 기관 캐뉼라쪽으로 내측 스테르노절제술을 확장하고 양쪽의 기관지를 연결 조직에서 방출합니다.
    4. 지금, 기관 캐뉼라 위의 기관 절제술. 기관지와 폐의 등쪽 고정이 절제됨에 따라 두개골 축에서 캐뉼라를 부드럽게 당깁니다.
  8. 캐니어레이션:
    1. 흉부에서 고립된 폐를 들어 올리고 페트리 접시에 멸균 거즈 위에 조심스럽게 놓습니다.
    2. atelectasis를 방지하기 위해 2cmH2O로 설정된 양압 환기를 사용하여 폐를 환기시하십시오.
    3. 대실 홈의 수준에서 심장을 잘라서 심실을 제거합니다.
    4. 두 개의 심실을 열후, 폐 동맥을 통해 바구니와 토끼에 대한 OD 4.6mm 폐 동맥 캐뉼라를 소개하고 왼쪽 아트리움에 모성 밸브를 통해 바구니와 토끼에 대한 OD 5.9mm 왼쪽 아트리움 캐뉼라를 소개합니다.
    5. 폐 동맥에 4-0 실크 봉합사를 사용하고 왼쪽 아트리움을 사용하여 캐뉼러를 수정하십시오. 이러한 구조의 팽창을 피하기 위해 폐 동맥의 합자 및 왼쪽 아트리움에 주변 조직을 포함한다.
    6. 동맥 캐뉼라를 통해 식염수 동소항용액 250mL를 주입하여 혈관 침대에서 남은 혈액을 플러시하십시오.

3. 관류 기술.

  1. 설치:
    1. 격리된 폐를 폐 챔버에 조심스럽게 넣습니다.
    2. 기관체를 챔버 의 표지에 있는 트랜스덕터에 부착합니다.
    3. 관류 시스템에 캐누액 선박을 연결합니다.
    4. 챔버를 닫고 회전 잠금 장치로 고정하십시오.
      참고: 재순환 관류 회로는 개방형 정맥 저수지, 연동 펌프, 열교환기 및 버블 트랩으로 구성됩니다.
    5. 이 시점에서 챔버 뚜껑을 부착하고 스톱콕을 통해 전환하여 양압 환기로 전환합니다. 폐의 음압 환기와 챔버의 밀폐 폐쇄를 확인하려면 압력 게이지에 대한 폐 및 챔버 압력의 호흡 소풍을 검사합니다.
    6. 200mL의 인공 혈액 이내 난부(소 알부민의 2.5%를 함유한 크렙스 링거 중탄산완충액)로 폐를 퍼퓨즈합니다.
    7. 3mL/min/kg에서 난투류 흐름을 시작한 다음 5분 동안 흐름을 5mL/min/kg으로 천천히 강화합니다. 다음 5분 동안 8mL/min/kg의 흐름에 도달한 다음 5분 후에 최대 10mL/min/kg의 플럭스에 도달합니다. 회로에 들어가는 공기를 피하는 것을 돌봐.
      참고: 생리 범위 내에서 퍼퓸의 pH 및 온도를 유지한다(pH 7.4-7.5; 온도, 37°C-38°C). pH를 조정하려면 NaHCO3(1N)를 추가하거나 이산화탄소의 흐름을 증가시면 됩니다. 또는 HCl(0.1N)을 사용하여 산성화하십시오.
  2. 매개 변수:
    1. 미리 정해진 관류 및 환기 매개 변수가 필요에 따라 설정되었는지 확인합니다.
    2. 30 bpm의 주파수에서 가습 공기, 10 mL/kg의 조수 부피 및 2cmH2O의 최종 만료 압력 (Pe)으로 폐를 환기시하십시오.
      참고: 폐 동맥 압력(0-20 mmHg)은 폐 트렁크 보다 센티미터 높은 산소레이터 또는 저수지의 액체 레벨의 높이에 해당하며, 폐 정맥 압력은 좌심방 위의 압력 평형 챔버의 높이에 해당한다. 두 값을 모두 수정할 수 있습니다. 왼쪽 아트리움 압력도 0-20 mmHg입니다.
  3. 영역 3 조건 달성:
    1. 폐 동맥에 고정된 캐뉼러의 측면 포트에 연결된 두 카테터를 사용하여 동맥(Pa) 및 정맥(Pv) 압력을 측정합니다.
    2. 폐 힐룸(제로 참조)의 수준에서 기준 압력을 설정합니다.
    3. 영역 3 환기 조건하에서 실험을 수행합니다. 이를 위해 10-15분 동안 대기하여 동위원소 상태를 특징으로 하는 평형을 얻습니다.
    4. 정맥 압력이 폐포 압력 (Palv)보다 높고 동맥 압력이 Zone 3 조건에 대한 두 가지 (Pa > Pv > Palv)보다 높은 상태로 유지되도록합니다.
    5. 폐의 무게가 일정하게 유지되고 동맥 및 왼쪽 심방 압력이 안정되어 최대 수의 폐 혈관을 열고 실험 중에 미세 혈관 침대 함량을 유지하기 위해 영역 3 조건을 달성하십시오.
      참고: 폐 부종의 지표로서 Kfc를 측정하는 것은 수동 및 자동 관류 시스템 사이에 차이가 없습니다.
  4. 전자 제어 및 신호 처리: 호흡기 흐름, 체중 변화, 미세 혈관 압력, 조수 부피, 혈관 저항 등이 트랜스듀서에서 나오는 신호를 통합하고 평가 시스템에 표시하는 여러 중앙 전자 장치에 등록되어 있는지 확인합니다.

결과

고립 된 폐 관류 시스템은 생검에 대한 장기 조작, 관류에서 샘플 수집 및 생리 적 매개 변수의 실시간 데이터 수집을 허용합니다. 고립 된 시스템은 다른 기능과 폐 현상을 포함 하는 많은 가설을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다., 신진 대사와 효소 활동에서 부 종 형성 및 폐 이식에 대 한 보존 기간.

도 1은 환기 시스템 및 계산된 데이터 수집과 함께...

토론

이 연구는 폐 생리학 연구에서 필수적인 기술인 고립된 폐 관류 시스템의 일반적인 견해를 표시합니다. 고립 된 폐 관류 시스템은 그것의 사용에 있는 다재다능성의 큰 정도를 제공하고 가설의 넓은 범위의 시험에서 관련있는 몇몇 매개변수의 평가를 허용합니다15. 고립 된 폐 시스템은 지난 10 년 동안 장기 별 평가를위한 관련성을 더욱 확립하고 중년 줄기 세포16

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

저자는 이 원고를 쓰는 베티나 소머 세르반테스 박사와 키치아 엘레나 라라 사폰트가 일러스트레이션을 지원해 준 것에 대해 감사를 표하고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/WhiteHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilationHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused LungHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powdersigma3912500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.JT Baker10035-04-8
Cryogenic vialsCorning4306592 mL
D-glucosa, C6H12O6.sigmaG5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE ConnectorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE ConnectorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC gradeCaledon
Falcon tubes14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)Hugo Sachs Elektronik (HSE)70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow rangeHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 HzHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9703
HeparinPISA5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)Alltech98121213150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe FilterMillexSLLGR04NL4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 VHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 LHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°CHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS ModuleHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2OJT Baker10034-99-8
Microcentrifuge TubeCorning430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)PISAQ-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter ModuleHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure RegulatorHugo Sachs Elektronik (HSE)73-1755
Potassium chloride, KCl.JT Baker3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4JT Baker7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)PISAQ-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCPHugo Sachs Elektronik (HSE)73-2806
Snap Cap Microcentrifuge TubeCostar36201.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3sigmaS6014
Sodium chloride, NaCl.sigmaS9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubesMasterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4163

참고문헌

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