Sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio

Riepilogo

La preparazione polmonare di coniglio isolata è uno strumento gold standard nella ricerca polmonare. Questa pubblicazione si propone di descrivere la tecnica sviluppata per lo studio dei meccanismi fisiologici e patologici coinvolti nella reattività delle vie aeree, nella conservazione polmonare e nella ricerca preclinica nel trapianto di polmone e nell'edema polmonare.

Abstract

Il sistema di perfusione polmonare isolato è stato ampiamente utilizzato nella ricerca polmonare, contribuendo a chiarire il funzionamento interno dei polmoni, sia micro che macroscopicamente. Questa tecnica è utile nella caratterizzazione della fisiologia e della patologia polmonare misurando le attività metaboliche e le funzioni respiratorie, comprese le interazioni tra sostanze circolatorie e gli effetti di sostanze inalate o perfuse, come nei test antidroga. Mentre i metodi in vitro prevedono l'affettamento e la coltura dei tessuti, il sistema di perfusione polmonare ex vivo isolato permette di lavorare con un organo funzionale completo rendendo possibile lo studio di una funzione fisiologica continua durante la ricreazione della ventilazione e della perfusione. Tuttavia, va notato che gli effetti dell'assenza di innervazione centrale e drenaggio linfatico devono ancora essere pienamente valutati. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere l'assemblaggio dell'apparato polmonare isolato, seguito dall'estrazione chirurgica e dalla cannulazione di polmoni e cuore da animali da laboratorio sperimentali, nonché di visualizzare la tecnica di perfusione e l'elaborazione del segnale dei dati. La vitalità media del polmone isolato varia tra 5-8 ore; durante questo periodo, la permeabilità capillare polmonare aumenta, causando edema e lesioni polmonari. La funzionalità del tessuto polmonare conservato è misurata dal coefficiente di filtrazione capillare (Kfc), utilizzato per determinare l'entità dell'edema polmonare nel tempo.

Introduzione

Brodie e Dixon descrissero per la prima volta il sistema di perfusione polmonare ex-vivo nel 1903 ¹. Da allora, è diventato uno strumento gold standard per lo studio della fisiologia, della farmacologia, della tossicologia e della biochimica dei ^polmoni2,3. La tecnica offre un modo coerente e riproducibile per valutare la fattibilità dei trapianti di polmone e per determinare l'effetto dei mediatori infiammatori come l'istamina, i metaboliti dell'acido arachidonico e la sostanza P, tra gli altri, nonché le loro interazioni durante fenomeni polmonari come broncocostrizione, atelettasia ed edema polmonare. Il sistema polmonare isolato è stato una tecnica chiave per svelare l'importante ruolo dei polmoni nell'eliminazione delle ammine biogeniche dalla circolazione ^generale4,5. Inoltre, il sistema è stato utilizzato per valutare la biochimica del tensioattivo ^polmonare6. Negli ultimi decenni, il sistema di perfusione polmonare ex-vivo è diventato una piattaforma ideale per la ricerca sui trapianti di ^polmone7. Nel 2001 un team guidato da Stig Steen ha descritto la prima applicazione clinica del sistema di perfusione polmonare ex-vivo utilizzandolo per ricondizionare i polmoni di un donatore di 19 anni, che inizialmente è stato respinto dai centri di trapianto a causa delle sue lesioni. Il polmone sinistro è stato raccolto e perfuso per 65 minuti; in seguito, è stato trapiantato con successo in un uomo di 70 anni con ^BPCO8. Ulteriori ricerche sul ricondizionamento polmonare utilizzando la perfusione ex-vivo hanno portato allo sviluppo della tecnica di Toronto per la perfusione polmonare estesa per valutare e trattare i polmoni dei donatori ^feriti9,10. Clinicamente, il sistema di perfusione polmonare ex-vivo ha dimostrato di essere una strategia sicura per aumentare i pool di donatori trattando e ricondizionando i polmoni dei donatori al di sotto degli standard, non presentando differenze significative nei rischi o negli esiti rispetto ai donatori di criteri ^standard10.

Il vantaggio principale del sistema di perfusione polmonare isolato è che i parametri sperimentali possono essere valutati in un organo funzionale completo che conserva la sua funzione fisiologica sotto un allestimento di laboratorio artificiale. Inoltre, consente la misurazione e la manipolazione della ventilazione meccanica polmonare per analizzare le componenti della fisiologia polmonare come la resistenza delle vie aeree, la resistenza vascolare totale, lo scambio di gas e la formazione di edema, che ad oggi non possono essere misurati con precisione in vivo su animali da ^laboratorio2. In particolare, la composizione della soluzione con cui viene perfuso il polmone può essere completamente controllata, consentendo l'aggiunta di sostanze per valutarne gli effetti in tempo reale e la raccolta di campioni dalla perfusione per ulteriori ^studi11. I ricercatori che lavorano con il sistema polmonare isolato dovrebbero tenere presente che la ventilazione meccanica provoca il decadimento del tessuto polmonare accorciando il suo tempo utile. Questa progressiva caduta dei parametri meccanici può essere significativamente ritardata ipergonfiando i polmoni occasionalmente durante il periodo dell'esperimento4. Tuttavia, la preparazione di solito non può durare più di otto ore. Un'altra considerazione per il sistema di perfusione polmonare ex-vivo è l'assenza di regolazione nervosa centrale e drenaggio linfatico. Gli effetti della loro assenza non sono ancora completamente compresi e potrebbero potenzialmente essere una fonte di pregiudizi in alcuni esperimenti.

La tecnica del sistema di perfusione polmonare isolata può essere eseguita nel modello di coniglio con un alto grado di consistenza e riproducibilità. Questo lavoro descrive le procedure tecniche e chirurgiche per l'implementazione della tecnica di perfusione polmonare isolata ex-vivo sviluppata per il modello di coniglio presso l'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias di Città del Messico, con l'intenzione di condividere le intuizioni e fornire una guida chiara sui passaggi chiave nell'applicazione di questo modello sperimentale.

Protocollo

Il sistema di perfusione isolato nel modello di coniglio è stato ampiamente utilizzato nel laboratorio di iperreattività bronchiale presso l'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Il protocollo include conigli neozelandesi con un peso approssimativo di 2,5-3 kg. Tutti gli animali sono stati tenuti in condizioni standard di vivaio e alimentazione ad libitum in conformità con le linee guida ufficiali messicane per gli animali da laboratorio (NOM 062-ZOO-1999) e sotto la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (^8a edizione, 2011). Tutte le procedure e i metodi di cura degli animali presentati in questo protocollo sono stati precedentemente approvati dal Comitato Etico dell'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.

NOTA: La preparazione del sistema di perfusione polmonare isolato comporta la morte deliberata di un animale in anestesia e tramite eutanasia.

1. Attrezzatura e preparazione degli apparecchi.

1. Disposizione dell'attrezzatura:
   1. Impostare un tavolo operatorio con dimensioni in base al peso del coniglio.
   2. Montare il coperchio del torace artificiale sulla colonna di acciaio con la camera di vetro sottostante e il ventilatore con una pompa a rulli ai lati.
   3. Assicurarsi che il coperchio sia facilmente inclinato per avere la cannula tracheale in linea con la trachea per consentire un collegamento più veloce.
2. Torace artificiale:
   NOTA: è una parte essenziale del sistema. È costituito da una camera di vetro rivestita d'acqua sigillata da una copertura speciale. La copertura funziona come il supporto dell'organo con le connessioni per cannulare la trachea e i vasi incorporati in essa.
   1. Impostare un getto venturi azionato da aria compressa per generare la pressione negativa all'interno del torace artificiale.
      NOTA: Il modulo di controllo della ventilazione (VCM) consente regolazioni separate delle pressioni inspiratorie e di fine espirazione, nonché della frequenza respiratoria e del rapporto tra durata inspiratoria e durata totale del ciclo.
3. Apparecchio:
   1. Assicurarsi che un apparecchio normalmente funzionante sia costituito da una colonna principale in acciaio montata su una piastra di base che contiene il torace artificiale, con lo pneumotachometro e il trasduttore di peso situati sopra di esso e dietro la bobina di preriscaldamento con una trappola a bolle.
   2. Collegare un trasduttore di pressione differenziale allo pneumotachometro e un altro alla pressione della camera. Impostare un diverso paio di trasduttori di pressione dietro il torace per misurare la perfusione e le pressioni venose.
   3. Collegare il calcio di commutazione sotto l'ossigenatore con un elettrodo di livello e il sistema di ventilazione accanto all'apparecchio.

2. Estrazione chirurgica del blocco cardiopolmonare.

1. Anestesia:
   1. Utilizzare una combinazione di un sedativo (xilazina) e un barbiturico (pentobarbital).
      NOTA: diversi cocktail anestetici possono essere utilizzati senza alcun effetto sui risultati sperimentali.
   2. In primo luogo, sedare i conigli sani della Nuova Zelanda con una singola iniezione intramuscolare di xilazina cloridrato (3-5 mg / kg). Assicurarsi che i conigli rimangano calmi e rilassati per consentire un'ulteriore manipolazione dopo pochi minuti dall'iniezione.
   3. Dopo la sedazione, utilizzare le vene marginali (laterali) dell'orecchio come accesso per anestetizzare i conigli con un'iniezione endovenosa di pentobarbital sodico (28 mg / kg).
2. Monitoraggio:
   1. Per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni cardiache e respiratorie, monitorare i seguenti parametri. Per valutare la profondità dell'anestesia, eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
   2. Assicurarsi che la mucosa sia rosa. Le sfumature blu o grigie indicano ipossia.
   3. Assicurarsi che la frequenza cardiaca sia compresa tra 120-135 battiti / min e che la temperatura corporea non scenda al di sotto di 36,5 ° C.
3. Posizionamento degli animali:
   1. Radere il busto del coniglio e posizionare l'animale sul tavolo operatorio in posizione supina. Posizionare il sistema di ventilazione vicino al tavolo, dietro la testa del coniglio, per consentire di collegare rapidamente le cannule dopo la tracheotomia per evitare danni tissulari.
4. Incisione e tracheotomia:
   1. Sezionare la pelle con un'incisione della linea mediana ventrale di 3-5 cm dal diaframma fino al collo.
   2. Con le forbici operanti, tagliare i 2/3 anteriori della trachea tra due anelli cartilaginei per inserire la cannula tracheale attraverso la membrana fibrosa tracheale.
   3. Inserire un 5 mm (diametro esterno; OD) cannula tracheale attraverso la membrana fibrosa tracheale e utilizzare una sutura di seta 4-0 per fissarla con cura.
   4. Posizionare una pinza o una pinzetta sotto la trachea per assicurarsi che la cannula non si pieghi contro la trachea.
5. Ventilazione a pressione positiva:
   1. Finché i polmoni rimangono al di fuori del torace artificiale, utilizzare una pompa di respirazione di piccole specie per ventilare una pressione positiva al fine di evitare il collasso polmonare durante l'intervento chirurgico.
   2. Avviare la ventilazione attraverso la cannula tracheale collegata alla pompa respiratoria rapidamente dopo la tracheotomia e prima che il torace venga aperto.
   3. Impostare il volume di marea a 10 ml/kg.
      NOTA: A seconda della configurazione dell'esperimento e del modello di torace artificiale, fornire una ventilazione a pressione positiva dalla stessa pompa di ventilazione utilizzata per fornire una pressione negativa o da una diversa, garantendo una rapida ri-cannulazione.
6. Toracotomia ed dissanguamento:
   1. Per accedere alla cavità toracica, utilizzare un bisturi o forbici per aprire la parete toracica ed eseguire una sternotomia mediale fino al terzo superiore del torace.
   2. Tenere le metà del torace aperte da due riavvolgitori. Diversi lembi polmonari di solito circondano il cuore.
   3. Localizzare la vena cava superiore e inferiore e riferirle con fili.
   4. Prima del dissanguamento dell'animale, identificare il ventricolo destro e iniettare 1000 UI/kg di eparina.
   5. Subito dopo l'iniezione, ligare la vena cava superiore e inferiore con il filo pre-looped ed eseguire il dissanguamento.
7. Raccolta cuore-polmone:
   1. Raccogli il blocco cardiopolmonare delicatamente e rapidamente. Utilizzare la dissezione digitale diretta o le forbici a molla per separare il tessuto connettivo in modo da rimuovere i polmoni dal torace.
   2. Sezionare la vascolarizzazione nell'area e l'esofago.
   3. Tagliare il manubrium sterni per estendere la sternotomia mediale verso la cannula tracheale, rilasciando la trachea su entrambi i lati dal tessuto di collegamento.
   4. Ora, resettare la trachea sopra la cannula tracheale. Tirare delicatamente la cannula in un asse craniocaudale mentre la fissazione dorsale della trachea e dei polmoni viene resecata.
8. Cannulazione:
   1. Sollevare i polmoni isolati dal torace e posizionarli con cura su una garza sterile su una capsula di Petri.
   2. Per prevenire l'atelettasia, ventilare i polmoni utilizzando la ventilazione a pressione positiva con pressione positiva di fine espirazione (PEEP) impostata a 2 _cmH2O.
   3. Rimuovere i ventricoli tagliandoli dal cuore a livello del solco atrioventricolare.
   4. Dopo aver aperto i due ventricoli, introdurre la cannula dell'arteria polmonare OD da 4,6 mm per il coniglio con un cesto attraverso l'arteria polmonare e introdurre la cannula dell'atrio sinistro OD 5,9 mm per il coniglio con il cestello attraverso la valvola mitrale nell'atrio sinistro.
   5. Utilizzare una sutura di seta 4-0 nell'arteria polmonare e nell'atrio sinistro per fissare le cannule. Includere i tessuti circostanti nelle legature dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro per evitare la distensione di queste strutture.
   6. Iniettare 250 mL di soluzione isotonica salina attraverso le cannule arteriose per lavare il sangue rimanente dal letto vascolare.

3. Tecnica di perfusione.

1. Apparecchio:
   1. Posizionare accuratamente i polmoni isolati nella camera polmonare.
   2. Attaccare la trachea al trasduttore sul coperchio della camera.
   3. Collegare i vasi cannulati al sistema di perfusione.
   4. Chiudere la camera e fissarla con la serratura rotante.
      NOTA: Il circuito di perfusione a ricircolo è costituito da un serbatoio venoso aperto, una pompa peristaltica, uno scambiatore di calore e una trappola a bolle.
   5. A questo punto, collegare il coperchio della camera e passare da un rubinetto per passare dalla ventilazione a pressione positiva a quella negativa. Per controllare la ventilazione a pressione negativa dei polmoni e la chiusura ermetica della camera, ispezionare l'escursione respiratoria del polmone e la pressione della camera sul manometro.
   6. Perfondere i polmoni con 200 ml di perfusato artificiale privo di sangue (un tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente il 2,5% di albumina bovina).
   7. Avviare il flusso di perfusato a 3 ml / min / kg, quindi aumentare lentamente il flusso in un periodo di 5 minuti a 5 ml / min / kg. Raggiungere una portata di 8 mL/min/kg nei successivi 5 min e poi dopo un altro periodo di 5 min raggiungere un flusso massimo di 10 mL/min/kg. Fare attenzione a evitare che l'aria entri nel circuito.
      NOTA: Mantenere il pH e la temperatura del perfusato entro intervalli fisiologici (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Per regolare il pH, aggiungere _NaHCO3 (1N) o aumentare il flusso di anidride carbonica. In alternativa, utilizzare HCl (0.1N) per acidificare.
2. Parametri:
   1. Verificare se i parametri di perfusione e ventilazione predeterminati sono impostati come richiesto.
   2. Ventilare i polmoni con aria umidificata ad una frequenza di 30 bpm, un volume di marea di 10 ml/kg e una pressione espiratoria finale (Pe) di 2 _cmH2O.
      NOTA: La pressione arteriosa polmonare (0-20 mmHg) corrisponde all'altezza del livello del liquido nell'ossigenatore o nel serbatoio in centimetri sopra il tronco polmonare, mentre la pressione venosa polmonare corrisponde all'altezza della camera di equilibrio della pressione sopra l'atrio sinistro. Entrambi i valori possono essere modificati. Si noti che anche la pressione dell'atrio sinistro è 0-20 mmHg.
3. Raggiungimento delle condizioni della zona 3:
   1. Utilizzare i due cateteri collegati alle porte laterali delle cannule fissate nell'arteria polmonare, nell'atrio sinistro e nei trasduttori di pressione per misurare le pressioni arteriose (Pa) e venose (Pv).
   2. Impostare le pressioni basali a livello dell'ilo polmonare (riferimento zero).
   3. Condurre gli esperimenti in condizioni di ventilazione della zona 3. Per raggiungere questo obiettivo, attendere 10-15 minuti per ottenere un equilibrio caratterizzato da uno stato isogravimetrico.
   4. Assicurarsi che la pressione venosa sia superiore alla pressione alveolare (Palv) e che la pressione arteriosa rimanga superiore a entrambe (Pa > Pv > Palv) affinché si verifichino condizioni di Zona 3.
   5. Assicurarsi che il peso dei polmoni rimanga costante e che le pressioni arteriose e atriali sinistre siano stabili per raggiungere le condizioni della zona 3 per aprire un numero massimo di vasi polmonari e mantenere il contenuto del letto microvascolare durante l'esperimento.
      NOTA: La misurazione di Kfc come indicatore di edema polmonare non ha variazioni tra un sistema di perfusione manuale e uno automatico.
4. Controllo elettronico ed elaborazione del segnale: assicurarsi che il flusso respiratorio, le variazioni di peso, la pressione microvascolare, il volume delle maree, la resistenza vascolare, tra gli altri, siano registrati su un'unità elettronica centrale multipla che integra i segnali provenienti dai trasduttori e li visualizza sul sistema di valutazione.

Risultati

Il sistema di perfusione polmonare isolato consente la manipolazione degli organi per la biopsia, la raccolta di campioni dalla perfusione e la raccolta di dati in tempo reale dei parametri fisiologici. Il sistema isolato può essere utilizzato per testare molte ipotesi che coinvolgono diverse funzioni e fenomeni polmonari, dall'attività metabolica ed enzimatica alla formazione dell'edema e ai periodi di conservazione per i trapianti polmonari.

La Figura 1 mostra...

Discussione

Questo lavoro mostra una visione generale del sistema di perfusione polmonare isolato, una tecnica essenziale nella ricerca sulla fisiologia polmonare. Il sistema di perfusione polmonare isolato offre un grande grado di versatilità nei suoi usi e consente la valutazione di diversi parametri rilevanti nella sperimentazione di una vasta gamma di ^ipotesi15. Un sistema polmonare isolato è uno strumento con presenza mondiale che, nell'ultimo decennio, ha ulteriormente stabilito la sua rilevanza per l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder	sigma	3912	500 g
Calcium chloride, CaCl2·2H2O.	JT Baker	10035-04-8
Cryogenic vials	Corning	430659	2 mL
D-glucosa, C6H12O6.	sigma	G5767
Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf tubes
Ethanol absolute HPLC grade	Caledon
Falcon tubes			14 mL
Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
Heparin	PISA		5000 UI
HPLC Column (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4.6 mm
Hydrophilic Syringe Filter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
Microcentrifuge Tube	Corning	430909
Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
New Zeland rabbits
PISABENTAL (Pentobarbital sodium)	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS Case, Type 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM Time Counter Module	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
Potassium chloride, KCl.	JT Baker	3040-01
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN (Xylacine clorhydrate)	PISA	Q-7833-099
Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
Scalpel knife
Serotonin 5-HT
Servo Controller for Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
Snap Cap Microcentrifuge Tube	Costar	3620	1.7 mL
Sodium bicarbonate, NaHCO3	sigma	S6014
Sodium chloride, NaCl.	sigma	S9888
Surgical gloves No. 7 1/2
Surgical gloves No. 8
Taygon tubes	Masterflex
Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163