Un modelo preclínico de golpe de calor por esfuerzo en ratones

Resumen

El protocolo describe el desarrollo de un modelo preclínico estandarizado, repetible y de golpe de calor por esfuerzo (EHS) en ratones libres de estímulos externos adversos como la descarga eléctrica. El modelo proporciona una plataforma para estudios mecanicistas, preventivos y terapéuticos.

Resumen

El golpe de calor es la manifestación más grave de las enfermedades relacionadas con el calor. El golpe de calor clásico (CHS), también conocido como golpe de calor pasivo, ocurre en reposo, mientras que el golpe de calor por esfuerzo (EHS) ocurre durante la actividad física. EhS difiere de CHS en etiología, presentación clínica y secuelas de disfunción multiorgánica. Hasta hace poco, solo los modelos de CHS han sido bien establecidos. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pautas para un modelo de ratón preclínico refinado de EHS que esté libre de factores limitantes importantes como el uso de anestesia, restricción, sondas rectales o descargas eléctricas. En este modelo se utilizaron ratones machos y hembras C57Bl/6, instrumentados con sondas telemétricas de temperatura central (Tc). Para familiarizarse con el modo de carrera, los ratones se someten a 3 semanas de entrenamiento utilizando ruedas de carrera voluntarias y forzadas. A partir de entonces, los ratones corren en una rueda forzada dentro de una cámara climática establecida a 37.5 ° C y 40% -50% de humedad relativa (HR) hasta mostrar limitación de síntomas (por ejemplo, pérdida de conciencia) a Tc de 42.1-42.5 ° C, aunque se pueden obtener resultados adecuados a temperaturas de cámara entre 34.5-39.5 ° C y humedad entre 30% -90%. Dependiendo de la gravedad deseada, los ratones se retiran de la cámara inmediatamente para su recuperación a temperatura ambiente o permanecen en la cámara calentada durante más tiempo, lo que induce una exposición más grave y una mayor incidencia de mortalidad. Los resultados se comparan con los controles de ejercicio simulados (EXC) y/o los controles ingenuos (NC). El modelo refleja muchos de los resultados fisiopatológicos observados en el EHS humano, incluida la pérdida de conciencia, la hipertermia grave, el daño multiorgánico, así como la liberación de citoquinas inflamatorias y las respuestas de fase aguda del sistema inmunológico. Este modelo es ideal para la investigación basada en hipótesis para probar estrategias preventivas y terapéuticas que pueden retrasar la aparición de EHS o reducir el daño multiorgánico que caracteriza esta manifestación.

Introducción

El golpe de calor se caracteriza por disfunción del sistema nervioso central y daño subsiguiente de los órganos en sujetos hipertérmicos¹. Hay dos manifestaciones de golpe de calor. El golpe de calor clásico (CHS) afecta principalmente a las poblaciones de edad avanzada durante las olas de calor o a los niños abandonados en vehículos expuestos al sol durante los calurosos días de verano¹. El golpe de calor por esfuerzo (EHS) ocurre cuando hay una incapacidad para termorregular adecuadamente durante el esfuerzo físico, típicamente, pero no siempre, bajo altas temperaturas ambientales que resultan en síntomas neurológicos, hipertermia y posterior disfunción y daño multiorgánico². EhS ocurre en atletas recreativos y de élite, así como en personal militar y en trabajadores con y sin deshidratación concomitante^3,4. De hecho, ehS es la tercera causa de mortalidad en atletas durante la actividad física⁵. Es extremadamente difícil estudiar ehS en humanos, ya que el episodio puede ser letal o conducir a resultados de salud negativos a largo plazo^6,7. Por lo tanto, un modelo preclínico confiable de EHS podría servir como una herramienta valiosa para superar las limitaciones de las observaciones clínicas retrospectivas y asociativas en víctimas humanas de EHS. Los modelos preclínicos de CHS en roedores y cerdos han sido bien caracterizados^8,9,10. Sin embargo, los modelos preclínicos de CHS no se traducen directamente en fisiopatología de EHS debido a los efectos únicos del ejercicio físico sobre el perfil termorregulador y la respuesta inmune innata¹¹. Además, los intentos anteriores de desarrollar modelos preclínicos de EHS en roedores plantearon restricciones significativas, incluidos estímulos de estrés superpuestos inducidos por descarga eléctrica, inserción de una sonda rectal y temperaturas corporales centrales máximas predefinidas con altas tasas de mortalidad^{12,13,14,15,16} que no coinciden con los datos epidemiológicos actuales. Estos representan limitaciones significativas que pueden confundir la interpretación de los datos y proporcionar índices de biomarcadores poco confiables. Por lo tanto, el protocolo tiene como objetivo caracterizar y describir los pasos de un modelo preclínico estandarizado, altamente repetible y traducible de EHS en ratones que está en gran medida libre de las limitaciones mencionadas anteriormente. Se describen los ajustes al modelo que pueden resultar en resultados fisiológicos graduales de golpe de calor moderado a fatal. Según el conocimiento de los autores, este es el único modelo preclínico de EHS con tales características, lo que permite llevar a cabo investigaciones relevantes de EHS de una manera basada en hipótesis^11,17,18.

Protocolo

Todos los procedimientos han sido revisados y aprobados por la Universidad de Florida IACUC. Para el estudio se utilizan ratones machos o hembras C57BL / 6J, de ~ 4 meses de edad, con un peso dentro de un rango de 27-34 g y 20-25 g, respectivamente.

1. Implantación quirúrgica del sistema telemétrico de monitorización de temperatura

1. A su llegada del vendedor, permita que los animales descansen en el vivero durante al menos 1 semana antes de la cirugía para minimizar el estrés del transporte.
2. El grupo aloja a los ratones (máximo de 5 por jaula según las pautas locales de IACUC) hasta el día de la cirugía para la implantación del dispositivo telemétrico de temperatura. Alojelos en jaulas estándar de 7.25" (W) x 11.75" (L) x 5" (H) que contengan ropa de cama de mazorca de maíz. Mantenga el ciclo de luz en un ciclo de luz de 12 x 12 (encendido: 7 AM; apagado: 7 PM). Mantenga la temperatura de la carcasa a 20-22 °C y la humedad relativa (HR) al 30%-60%. Proporcione la dieta estándar de chow y agua ad libitum hasta el protocolo EHS.
   NOTA: La justificación para el alojamiento individual es evitar lesiones de lucha frecuentes en ratones machos C57bl / 6J y proporcionar una amplia oportunidad para el funcionamiento espontáneo de la rueda para cada ratón.
3. Para la colocación de los dispositivos de telemetría, anestesiar el ratón con isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min de flujo de O₂₎ en una cámara de inducción. Luego, coloque al ratón bajo anestesia continua a través de un cono nasal (1.5%, 0.6 L / min).
4. Use lubricante para los ojos, como un ungüento veterinario, para proteger los ojos del animal de daños o lesiones durante la cirugía.
5. Para preparar el sitio quirúrgico, afeite la parte inferior del abdomen con cortapelos de animales pequeños o use un removedor de pelo disponible comercialmente. Administrar la primera dosis de buprenorfina subcutánea (0,1 mg/kg) durante este tiempo.
6. Frote el área con tres lavados de povidona yodada (o exfoliante germicida similar) seguido de un enjuague con alcohol isopropílico al 70% (o solución salina estéril según los requisitos veterinarios locales). Luego, transfiera el mouse al área quirúrgica.
7. Use una cortina adhesiva para aislar el sitio quirúrgico en el ratón. Usando instrumentos estériles y técnica aséptica, haga una incisión de ~ 1 cm en la línea media a lo largo de la línea alba, a unos 0,5 cm del margen costal. Luego, separe la piel de la capa muscular y haga una incisión ligeramente más pequeña en la línea alba, con cuidado de no dañar los intestinos o los órganos internos.
8. Una vez que la capa muscular esté abierta, coloque el telémetro estéril (dispositivo de radiotelemetría reutilizable en miniatura sin batería; 16,5 x 6,5 mm) en la cavidad intraperitoneal frente a las arterias y venas caudales y dorsal a los órganos digestivos para permitir que flote libremente.
   NOTA: Todos los telemetros se limpian con agua y jabón, se enjuagan a fondo y se esterilizan con gas con óxido de etileno entre usos. Si la esterilización por gas no está disponible, se acepta la inmersión en soluciones de esterilización (siguiendo la recomendación del fabricante para la dilución y el tiempo de inmersión) para desinfectar y esterilizar los telemetros.
9. Cierre la abertura abdominal con una sutura estéril absorbible 5-0 y cierre la piel con una simple sutura interrumpida con sutura de prolina 5-0.
   NOTA: Permitir que el telémetro flote en el compartimento abdominal sin atarlo a la pared abdominal (un método recomendado por el fabricante) ha demostrado ser exitoso y preferido por los autores para eliminar el exceso de tensión en la pared abdominal durante la curación. Además, esto no tiene ningún impacto en la capacidad del receptor para obtener la señal del emisor.
10. Coloque el ratón en su jaula limpia con una almohadilla térmica portátil debajo de la jaula. Monitoree al ratón cada 15 minutos durante la primera hora de recuperación de la anestesia y luego regrese a la instalación de alojamiento de animales.
11. Proporcionar a los ratones inyecciones subcutáneas de buprenorfina cada 12 h durante 48 h durante la recuperación y continuar monitoreando los signos de angustia. Si está disponible, administre buprenorfina de liberación lenta por vía subcutánea cada 24 h (1 mg/kg) durante 48 h. Permita que los ratones se recuperen durante ~ 2 semanas después de la cirugía antes de introducir una carrera de rueda voluntaria.

2. Familiarización: carrera de ruedas voluntaria y forzada

1. Después de la recuperación de la cirugía, coloque las ruedas de carrera voluntarias en la jaula para acceder libremente a la rueda. Otras selecciones de ruedas de rodadura pueden ser igualmente efectivas, pero asegúrese de que se ajuste a los tamaños limitados de jaula disponibles.
   NOTA: Las ruedas de rodadura tuvieron que reducirse ligeramente en dimensión para caber en una jaula estándar.
2. Aclimata el ratón a la rueda voluntaria en la jaula durante 2 semanas. Una vez aclimatado, el ratón está listo para el entrenamiento con los procedimientos de familiarización para las ruedas de carrera forzadas.
3. Realice las cuatro sesiones de entrenamiento (una /día) en la cámara ambiental a temperatura ambiente (~ 25 ° C, 30% de humedad relativa).
   NOTA: Aunque esto es ideal, los ratones también fueron entrenados con éxito en ruedas de carrera forzadas idénticas fuera de la cámara. Varios ratones pueden ser entrenados simultáneamente sin interferir con el uso de la cámara.
4. Para comenzar la primera sesión de entrenamiento, permita que el ratón libere la rueda en la rueda de rodadura modificada durante 15 minutos quitando o aflojando la correa de transmisión del motor para permitir que el ratón determine la velocidad de la rueda y se aclimate a ella de una manera no estresante.
   NOTA: Los protocolos se pueden ejecutar con software y hardware suministrados por el fabricante de la rueda en ejecución o pueden ser sustituidos por una fuente de alimentación programable externa que está conectada directamente al motor de la rueda, lo que permite la automatización del protocolo de ejercicio incremental.
5. Calibre el sistema para cada rueda de rodadura para determinar la relación entre la tensión de la fuente de alimentación y los medidores/minuto (m/min) de cada rueda.
   NOTA: Las ruedas de rodadura forzada también se modificaron para elevar el motor 15 cm, invertir y mover la polea que impulsa la rueda hasta 5 cm por encima de la plataforma receptora de telemetría. Esto aseguró que la plataforma receptora obtuviera datos de telemetría precisos durante el protocolo de funcionamiento sin interferencias del motor.
6. Después de un breve período de descanso (<5 min), inicie el protocolo de rueda de carrera forzada. Encienda la rueda a 2,5 m/min y aumente 0,3 m/min cada 10 min durante un total de 1 h para imitar la primera hora de la prueba real de EHS, pero a temperatura ambiente. Devuelva el ratón a su jaula de origen y permita una recuperación de 24 horas. Llevar a cabo las siguientes tres sesiones de ejecución forzada de la misma manera en días consecutivos. Después del día 1, la parte de aclimatación de rueda libre es innecesaria.
7. Permita que el ratón 2-3 días de lavado o recuperación del estrés de la práctica de la rueda de carrera forzada, pero permita que el ratón tenga acceso libre a la rueda voluntaria de la jaula doméstica. El ratón ahora está preparado para someterse al protocolo EHS.

3. Protocolo EHS

1. La noche antes del protocolo EHS, coloque el ratón en la cámara ambiental a temperatura ambiente (~ 25 ° C, ≈30% de humedad relativa) para aclimatarse a la cámara.
2. Utilice un sistema de adquisición de datos para recopilar Tc continuos, promediados en intervalos de 30 s durante la noche.
3. En la mañana del protocolo EHS, asegúrese de que el ratón esté en o por debajo de un rango normal de temperatura diurna antes de aumentar la temperatura de la cámara (es decir, 36-37.5 ° C). Esto asegura que el ratón no tenga fiebre y no haya experimentado estrés indebido durante este período.
4. Una vez que el ratón esté estable y dentro de un rango de temperatura central normal en reposo, retire la comida y el agua y pese al animal. Cierre la puerta de la cámara y aumente la temperatura de la cámara a un objetivo de 37.5 ° C y 40% -50% de humedad relativa, o la temperatura y humedad ambiental deseada¹⁹. Verifique la temperatura y la humedad de la cámara con un monitor de temperatura y humedad calibrado.
5. Rodee la cámara con una cortina opaca para mantener la luz y las perturbaciones mínimas durante el protocolo. Supervise el ratón continuamente durante el protocolo a través de cámaras remotas iluminadas por infrarrojos. Enfoca una segunda cámara en el monitor de temperatura y humedad, colocada cerca de la rueda de rodadura. Realice cualquier ajuste en el controlador para el punto de ajuste de la cámara ambiental para garantizar lecturas de temperatura precisas cerca del animal.
6. Una vez que la cámara haya alcanzado su temperatura objetivo medida por la segunda cámara en el monitor de temperatura (esto puede tomar ~ 30 minutos), abra rápidamente la puerta de la cámara y coloque el mouse en la rueda de carrera forzada.
7. Inicie el protocolo de rueda de carrera forzada a una velocidad de 2,5 m/min y aumente la velocidad 0,3 m/min cada 10 min hasta que el ratón alcance un Tc de 41 °C. Una vez que el ratón haya alcanzado esta temperatura central, permita que la velocidad permanezca constante hasta la limitación de los síntomas, caracterizada por una aparente pérdida de conciencia, una caída hacia atrás o un desmayo, y la incapacidad de continuar corriendo o aferrarse a la rueda. Confirme este punto de tiempo cuando el mouse tiene tres rotaciones hacia atrás en la rueda sin signos de una respuesta física. Alternativamente, identifique un punto final humano siguiendo las reglas locales de IACUC para determinar cuándo detener el protocolo (por ejemplo, cuando Tc ~ 43 ° C). Este criterio de valoración está ligeramente por encima de la limitación de los síntomas en prácticamente todos los ratones.
8. Para realizar el protocolo de enfriamiento rápido (R), una vez que el mouse alcance la limitación de síntomas, detenga la rueda y retírela inmediatamente de la rueda de carrera forzada. Pesa el ratón y colócalo de nuevo en su jaula doméstica para recuperarlo a temperatura ambiente. Durante este tiempo, deje la puerta de la cámara abierta y devuelva el punto de ajuste de la incubadora a temperatura ambiente para permitir que la cámara se enfríe rápidamente. Este procedimiento da como resultado una supervivencia a largo plazo del >99%.
9. Para realizar una exposición más severa (S) a EHS, mantenga la jaula casera del animal dentro de la cámara de 37.5 ° C durante el protocolo EHS. Cuando el animal alcance la limitación de los síntomas, permítale permanecer en la rueda de carrera hasta que regrese a la conciencia según lo observado por la cámara remota (~ 5-9 min).
10. Luego retire rápidamente el mouse de la rueda de carrera y devuélvalo directamente a su jaula precalentada para dar como resultado un perfil de enfriamiento mucho más lento(Figura 1A,línea discontinua roja), eliminando esencialmente la fase hipotérmica de EHS. Retire la parte superior del filtro de la jaula durante este tiempo para mejorar el equilibrio con la cámara.
11. Utilice una jaula de recuperación preenfriada a temperatura ambiente para realizar un procedimiento alternativo menos severo que resulte en una fase hipotérmica suprimida pero con una tasa de supervivencia del 100%²⁰.
12. Para el protocolo S, supervise cuidadosamente el ratón durante la recuperación y compruebe continuamente si hay puntos finales humanitarios. Aunque es difícil probar de forma remota los puntos finales humanos de uso común (por ejemplo, el reflejo de enderezamiento), observe a los ratones de forma remota para detectar movimientos normales durante la recuperación, como aseo, respiración normal, lamer, etc. Monitoree el Tc durante este tiempo.
13. Es poco probable que los ratones se recuperen si su temperatura central invierte la dirección durante la fase de recuperación, eventualmente superando los 40 ° C; en este momento, finalice el experimento y evalúe el ratón para los puntos finales humanos estándar.

Resultados

Los perfiles termorreguladores típicos durante la totalidad del protocolo EHS y la recuperación temprana de un ratón se ilustran en la Figura 1A. Este perfil comprende cuatro fases distintas que se pueden definir como la etapa de calentamiento de la cámara, la etapa de ejercicio incremental, la etapa de ejercicio en estado estacionario y una etapa de recuperación mediante un método de enfriamiento rápido (R) o severo (S)¹⁷. Los principales resultados termorregu...

Discusión

Esta revisión técnica tiene como objetivo proporcionar pautas para el rendimiento de un modelo preclínico de EHS en ratones. Se proporcionan pasos detallados y materiales necesarios para la ejecución de un episodio de EHS reproducible de gravedad variable. Es importante destacar que el modelo imita en gran medida los signos, síntomas y disfunción multiorgánica observados en víctimas humanas de EHS^11,19. Además, este modelo permite examinar el mecanismo s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.