マウスにおける運動熱中症の前臨床モデル

要約

このプロトコルは、感電などの有害な外部刺激を含まないマウスにおける運動熱中症(EHS)の標準化された、反復可能な前臨床モデルの開発を記述する。このモデルは、機械治療、予防、および治療研究のためのプラットフォームを提供します。

要約

熱中症は、熱関連疾患の最も深刻な症状です。従来の熱中症(CHS)は、受動的な熱中症としても知られ、安静時に起こるのに対し、運動熱中症(EHS)は身体活動中に起こる。EHSは、多臓器機能障害の病因、臨床プレゼンテーション、および後遺症におけるCHSとは異なる。最近まで、CHSのモデルだけが確立されています。このプロトコルは、麻酔、拘束、直腸プローブ、感電などの主要な制限要因から解放されたEHSの洗練された前臨床マウスモデルのガイドラインを提供することを目的としています。雄および雌のC57Bl/6マウスは、コア温度(Tc)テレメトリプローブを用いたこのモデルに利用された。ランニングモードに慣れるには、マウスは自主的な走輪と強制走行ホイールの両方を使用して3週間のトレーニングを受けます。その後、マウスは、42.1〜42.5°CのTcで症状の制限(意識喪失など)を表示するまで、37.5°Cおよび40%-50%相対湿度(RH)に設定された気候室内の強制ホイールで走るが、34.5〜39.5°Cと湿度30%90°Cの間のチャンバー温度で適切な結果を得ることができる。所望の重症度に応じて、マウスは周囲温度の回復のためにすぐにチャンバーから取り出されるか、またはより長い期間加熱された部屋に留まり、より重度の暴露および死亡率のより高い発生率を誘発する。結果は、シャムマッチエクササイズコントロール(EXC)および/またはナイーブコントロール(NC)と比較されます。このモデルは、意識喪失、重度の温熱療法、多臓器損傷、炎症性サイトカイン放出、免疫系の急性期応答など、ヒトEHSで観察された病態生理学的転帰の多くを反映している。このモデルは、EHSの発症を遅らせたり、この症状を特徴づける多臓器損傷を減らしたりする予防および治療戦略をテストするための仮説主導の研究に最適です。

概要

熱中症は、中枢神経系機能障害およびその後の高^{体温被験者における}臓器損傷を特徴とする。熱中症には2つの症状があります。古典的な熱中症(CHS)は、暑い夏の日に太陽にさらされた車に残された熱波や子供の間に主に高齢者の集団に影響を与えます¹.運動熱中症(EHS)は、身体運動中に十分に熱調節することができない場合に生じ、通常、常に、神経症状、温熱療法、およびそれに続く多臓器機能不全および損傷をもたらす高い周囲温度の下で^2。EHSは、レクリエーションやエリートアスリートだけでなく、軍人や労働者の中で、付随する脱水^3、4で発生します。実際、EHSは身体活動中のアスリートの死亡率の第3位の原因^である5.エピソードは致命的であるか、長期的な否定的な健康結果につながる可能性がありますので、人間のEHSを研究することは非常に困難です^6,7.したがって、EHSの信頼性の高い前臨床モデルは、ヒトEHSの犠牲者における遡及的および連想的臨床観察の限界を克服するための貴重なツールとして役立つ可能性がある。げっ歯類や豚のCHSの前臨床モデルは^{、8、9、10でよく特徴付}けられています。しかし、CHSの前臨床モデルは、体温調節プロファイルおよび自然免疫応答¹¹に対する身体運動の独特の効果のために、EHS病態生理学に直接変換しない。さらに、げっ歯類における前臨床EHSモデルの開発に関する以前の試みは、感電による過重応力刺激、直腸プローブの挿入、および高い死亡率^{12、13、14、15、16}の事前定義された最高コア体温を含む、重要な制限を提起した 現在の疫学的データと一致しない。これらは、データ解釈を混乱させ、信頼性の低いバイオマーカーインデックスを提供する可能性のある重大な制限を表しています。したがって、このプロトコルは、上記の制限からほとんど自由であるマウスにおけるEHSの標準化された、非常に再現性の高い、翻訳可能な前臨床モデルのステップを特徴付け、記述することを目的としている。中等度から致命的な熱中症の結果を段階的に生じ得るモデルの調整について説明する。著者らの知る限りでは、これは、このような特性を持つEHSの唯一の前臨床モデルであり、仮説主導的な方法で関連するEHS研究を追求することを可能にする^{11、17、18。}

プロトコル

すべての手順は、フロリダ大学IACUCによって見直され、承認されています.C57BL/6J雄マウスまたは雌マウスは、生後〜4ヶ月、それぞれ27〜34gおよび20〜25gの範囲内で重量を量り、研究に使用される。

1. 遠隔測定温度監視システムの外科的移植

1. ベンダーから到着すると、動物は、輸送のストレスを最小限に抑えるために、手術前に少なくとも1週間のビバリウムで休むことを可能にします。
2. グループは、温度テレメトリデバイスの移植のための手術の日までマウス(ローカルIACUCガイドラインの下でケージあたり最大5)を収容します。標準の7.25"(W)x 11.75"(L)x 5"(H)コーンコブ寝具を含むケージに入れておきます。12 x 12 のライト サイクルでライト サイクルを維持します(オン:午前 7 時、オフ:午後 7 時)。ハウジング温度を20~22°C、相対湿度(RH)を30~60%に保ちます。EHSプロトコルまで標準的なチャウダイエットと水 のアドリビタム を提供します。
   注:個々の住宅の根拠は、雄のC57bl / 6Jマウスで頻繁に戦う怪我を避け、マウスごとに自発的なホイールを走る十分な機会を提供することです。
3. テレメトリデバイスの配置には、誘導チャンバー内のイソフルラン(O₂ フローの4%、0.4-0.6 L/分)でマウスを麻酔します。次に、鼻コーン(1.5%、0.6 L/分)を介して連続麻酔下にマウスを置きます。
4. 獣医軟膏などの目の潤滑油を使用して、手術中の損傷や怪我から動物の目を保護します。
5. 手術部位を準備するには、小さな動物の毛バリカンで下腹部を剃るか、市販のヘアリムーバーを使用します。この間に皮下ブプレノルフィン(0.1 mg/kg)の最初の用量を投与する。
6. ポビドンヨウ素(または同様の殺菌スクラブ)の3回の洗浄で領域をスクラブし、続いて70%イソプロピルアルコールリンス(または地元の獣医の要件に応じて滅菌生理食動物)を続けます。次に、マウスを手術領域に移す。
7. 接着剤のドレープを使用して、マウスの外科部位を分離します。滅菌器具と無菌技術を使用して、リネアアルバに沿って中線に約1cmの切開を行い、肋間から約0.5cm離れたところに切り込みます。次に、筋肉層から皮膚を分離し、リネアアルバ上でわずかに小さい切開を行い、腸または内臓に損傷を与えないように注意する。
8. 筋肉層が開いたら、無菌テレメーター(ミニチュア再利用可能な電池フリー放射テレメトリデバイス;16.5 x 6.5 mm)を口蓋動脈と静脈の前の腹腔内腔に入れ、消化器官に腹筋を自由に浮かばします。
   注:すべてのテレメーターは、使用の間にエチレンオキシドで完全に洗い流し、ガスを洗浄し、石鹸と水で洗浄されます。ガス滅菌が利用できない場合、テレメータの消毒および滅菌に対して、滅菌液(希釈および浸漬時間に関するメーカーの推奨に従う)に浸漬することが認められます。
9. 無菌5-0吸収性縫合糸で腹部の開口部を閉じ、5-0プロリン縫合糸で簡単に中断されたステッチを使用して皮膚を閉じます。
   注:テレメーターが腹壁(製造業者が推奨する方法)に結びつけずに腹部コンパートメントに浮かぶようにすることは、治癒中に腹壁の余分な緊張を排除するために著者によって成功し、好まれると実証されています。さらに、これは、エミッタから信号を得る受信機の能力に影響を与えるしません。
10. ケージの下にポータブルヒーターパッドを備えたきれいなケージにマウスを置きます。麻酔からの回復の最初の時間の間に15分ごとにマウスを監視し、その後、動物の住宅施設に戻ります。
11. 回復中に48時間毎に12時間ごとに皮下ブプレノルフィン注射をマウスに提供し、苦痛の徴候を監視し続ける。利用可能な場合, 48 時間の 24 時間 (1 mg/kg) ごとに皮下に徐放ブプレノルフィンを与えます。マウスは、任意のホイールを実行する前に、手術後約2週間回復することができます.

2. 慣れ親しんだ:自発的な、強制車輪の走り

1. 手術からの回復後、任意のランニングホイールをケージに入れ、車輪に自由にアクセスします。他の走行ホイールの選択も同様に有効ですが、利用可能な限られたケージサイズ内に収まることを確認してください。
   注: 標準のケージに収まるように、ランニングホイールの寸法を少し減らす必要がありました。
2. マウスをケージ内の任意の車輪に2週間順応します。一度順応すると、マウスは強制走行ホイールのための慣れ親しんだ手順で訓練の準備ができています。
3. 室温(〜25°C、相対湿度30%)で環境室で4回のトレーニングセッション(1日)を行います。
   注:これは理想的ですが、マウスはチャンバーの外で同一の強制走輪で訓練に成功しました。いくつかのマウスは、チャンバーの使用を妨げることなく同時に訓練することができます。
4. 最初のトレーニングセッションを開始するには、モータードライブベルトを取り外したり緩めたりして、マウスがホイールの速度を決定し、ストレスのない方法で順応できるようにすることで、マウスを15分間、変更された走行輪の中で自由にします。
   注: プロトコルは、走行中のホイールメーカーが提供するソフトウェアとハードウェアで実行することも、ホイールモーターに直接配線された外部プログラマブル電源によって置き換えられる場合もあります。
5. 各走行輪のシステムを調整して、各ホイールの電源電圧とメートル/分(m/分)の関係を決定します。
   注:強制走行ホイールは、モーターを15cm上昇させ、反転し、ホイールを駆動するプーリーをテレメトリレシーバプラットフォームの5cm上に移動するように変更されました。これにより、受信機プラットフォームは、モータからの干渉なしに、実行プロトコル中に正確なテレメトリデータを取得することを保証しました。
6. 短時間の休息期間(<5分)の後、強制実行ホイールプロトコルを開始します。2.5 m/minでホイールを開始し、実際のEHSトライアルの最初の1時間を模倣するために合計1時間、10分ごとに0.3 m/minを増加させますが、室温で。マウスをホームケージに戻し、24時間の回復を可能にします。連続した日に同じ方法で、その後の 3 つの強制実行セッションを実行します。1日目以降、自由奔放な順応部分は不要である。
7. マウスの2〜3日間のウォッシュアウトまたは強制的な走行ホイールの練習のストレスからの回復を許可しますが、マウスはホームケージの任意のホイールに自由にアクセスできるようにします。マウスは EHS プロトコルを受け取る準備が整いました。

3. EHSプロトコル

1. EHSプロトコルの前夜、室温(〜25°C、相対湿度 ≈30%)の環境室にマウスを置き、チャンバーに順応させる。
2. データ取得システムを使用して、一晩で平均30s間隔で連続的なTcを収集します。
3. EHS プロトコルの朝、チャンバー温度を上昇させる前に、マウスが通常の日盛り温度範囲以下であることを確認してください(すなわち、36-37.5 °C)。これにより、マウスは発熱を起さないため、この期間中に過度のストレスを経験していません。
4. マウスが安定し、通常の安静時コア温度の範囲内で、食品と水を除去し、動物の重量を量る。チャンバードアを閉め、チャンバー温度を37.5°Cと40%-50%の相対湿度、または所望の環境温度と湿度¹⁹の目標に上げる。温度と湿度を校正したモニターでチャンバーの温度と湿度を確認します。
5. プロトコル中に光と妨害を最小限に抑えるために、遮光カーテンでチャンバーを囲みます。リモートIR照明カメラを介してプロトコル中にマウスを継続的に監視します。2台目のカメラを温度と湿度モニターに焦点を合わせ、走行中のホイールの近くに置きます。環境チャンバのセットポイントのコントローラに調整を加え、動物の近くの正確な温度測定値を確保します。
6. チャンバーが温度モニターの2番目のカメラで測定した目標温度に達したら(これは〜30分かかる)、すぐにチャンバードアを開け、強制的な走行ホイールにマウスを置きます。
7. 2.5 m/minの速度で強制走行ホイールプロトコルを開始し、マウスが41°CのTcに達するまで10分ごとに速度0.3 m/minを上げます。 マウスがこのコア温度に達すると、意識の明らかな喪失、後方転倒または失神、および車輪に対する走り続けや保持を継続できないことが特徴の症状の限界まで、速度を一定に保ちます。マウスが物理的な応答の兆候なしにホイール上に 3 つの後方回転を持っている場合、この時点を確認します。あるいは、ローカルのIACUC規則に従って人道的エンドポイントを特定し、プロトコルを停止するタイミング(例えば、Tc〜43°Cの場合)を決定します。このエンドポイントは、本質的にすべてのマウスにおける症状の制限をわずかに上回る。
8. 急速冷却プロトコル (R) を実行するには、マウスが症状の制限に達したら、ホイールを停止し、強制実行ホイールからすぐに取り外します。マウスの重量を量り、室温で回復するためにホームケージに戻します。この間、チャンバードアを開いたままにして、チャンバーが急速に冷却できるようにインキュベーターの設定ポイントを室温に戻します。この手順は>99%の長期生存をもたらす。
9. より重度の(S)EHS暴露を行うために、EHSプロトコル中に37.5°Cチャンバー内に動物の家のケージを保管してください。動物が症状の制限に達したら、遠隔カメラで観察された意識に戻るまで走行中の車輪に留まるようにします(〜5〜9分)。
10. 次に、マウスを走行ホイールから素早く取り外し、あらかじめ温めたケージに直接戻して、冷却プロファイル(図1A、赤い破線)を遅くし、EHS低体温相を本質的に排除します。この間、ケージからフィルタートップを取り外してチャンバとの平衡を改善します。
11. 予備冷却された回復ケージを室温に使用して、低体温相を抑制するが生存率100%を有する、より重篤な代替手順を実行する。
12. S プロトコルでは、回復中にマウスを注意深く監視し、人道的なエンドポイントを継続的に確認します。一般的に使用される人道的エンドポイント(例えば、右反射)をリモートでテストすることは困難ですが、グルーミング、正常呼吸、舐めなどの回復中にマウスを遠隔で観察します。この間、Tc を監視します。
13. マウスは、回復段階でコア温度が方向を逆転し、最終的に40°Cを超えると回復する可能性は低くなります。この時点で、実験を終了し、標準的なヒューマンエンドポイントのマウスを評価します。

結果

EHS プロトコル全体およびマウスの早期回復の間の典型的な体温調節プロファイルを 図 1Aに示します。このプロファイルは、チャンバー加熱ステージとして定義できる4つの異なる相、インクリメンタル運動段階、定常運動段階、および急速冷却(R)または重度(S)法¹⁷のいずれかによる回復段階を含む。主な体温調節結果は、達成された最大Tc(Tc,max)とTc,max?...

ディスカッション

この技術レビューは、マウスにおけるEHSの前臨床モデルのパフォーマンスに関するガイドラインを提供することを目的としています。可変的な大等性の再現可能なEHSエピソードの実行に必要な詳細なステップと材料が提供される。重要なことに、このモデルは、ヒトEHSの犠牲者^11、19で観察される徴候、症状^、および多臓器機能不全を主に模倣^する?...

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