Доклиническая модель теплового удара при физической нагрузке у мышей

Резюме

Протокол описывает разработку стандартизированной, повторяемой, доклинической модели теплового удара при физической нагрузке (EHS) у мышей, свободных от неблагоприятных внешних раздражителей, таких как поражение электрическим током. Модель обеспечивает платформу для механистических, профилактических и терапевтических исследований.

Аннотация

Тепловой удар является наиболее тяжелым проявлением заболеваний, связанных с жарой. Классический тепловой удар (CHS), также известный как пассивный тепловой удар, происходит в состоянии покоя, тогда как тепловой удар при физической нагрузке (EHS) происходит во время физической активности. EHS отличается от CHS этиологией, клинической картиной и последствиями полиорганной дисфункции. До недавнего времени хорошо зарекомендовали себя только модели CHS. Этот протокол направлен на предоставление руководящих принципов для уточненной доклинической мышиной модели EHS, которая свободна от основных ограничивающих факторов, таких как использование анестезии, сдерживания, ректальных зондов или поражения электрическим током. В этой модели использовались самцы и самки мышей C57Bl/6, оснащенные телеметрическими зондами температуры ядра (Tc). Для ознакомления с режимом бега мыши проходят 3 недели тренировок с использованием как добровольных, так и принудительных ходовых колес. После этого мыши бегут на принудительном колесе внутри климатической камеры, установленной при 37,5 °C и относительной влажности 40%-50% (RH) до проявления ограничения симптомов (например, потери сознания) при Tc 42,1-42,5 °C, хотя подходящие результаты могут быть получены при температуре камеры между 34,5-39,5 °C и влажностью между 30%-90%. В зависимости от желаемой тяжести мыши немедленно удаляются из камеры для восстановления температуры окружающей среды или остаются в нагретой камере в течение более длительного времени, вызывая более серьезное воздействие и более высокую частоту смертности. Результаты сравниваются с фиктивным контролем упражнений (EXC) и / или наивным контролем (NC). Модель отражает многие патофизиологические исходы, наблюдаемые при EHS человека, включая потерю сознания, тяжелую гипертермию, повреждение нескольких органов, а также воспалительное высвобождение цитокинов и реакции острой фазы иммунной системы. Эта модель идеально подходит для исследований, основанных на гипотезах, для проверки профилактических и терапевтических стратегий, которые могут задержать начало EHS или уменьшить повреждение нескольких органов, характеризующее это проявление.

Введение

Тепловой удар характеризуется дисфункцией центральной нервной системы и последующим поражением органов у гипертермических субъектов^1. Выделяют два проявления теплового удара. Классический тепловой удар (CHS) поражает в основном пожилое население во время тепловых волн или детей, оставленных в автомобилях, подвергающихся воздействию солнца в жаркие летние^дни1. Тепловой удар при физической нагрузке (EHS) возникает, когда есть неспособность адекватно терморегулироваться во время физических нагрузок, как правило, но не всегда, при высоких температурах окружающей среды, что приводит к неврологическим симптомам, гипертермии и последующей полиорганной дисфункции и повреждению^2. EHS встречается у рекреационных и элитных спортсменов, а также военнослужащих и у рабочих с сопутствующим обезвоживанием и без него^3,4. Действительно, EHS является третьей по значимости причиной смертности у спортсменов во время физической активности^5. Чрезвычайно сложно изучать EHS у людей, так как эпизод может быть смертельным или привести к долгосрочным негативным последствиям для здоровья^6,7. Таким образом, надежная доклиническая модель EHS может служить ценным инструментом для преодоления ограничений ретроспективных и ассоциативных клинических наблюдений у жертв EHS человека. Доклинические модели CHS у грызунов и свиней были хорошо охарактеризованы^8,9,10. Однако доклинические модели CHS напрямую не переводятся в патофизиологию EHS из-за уникального воздействия физических упражнений на терморегуляторный профиль и врожденный иммунный ответ^11. Кроме того, предыдущие попытки разработать доклинические модели EHS у грызунов накладывали значительные ограничения, включая наложенные стрессовые стимулы, вызванные электрическим током, установку ректального зонда и предопределенные максимальные температуры тела с высокими показателями смертности^{12,13,14,15,16.} которые не соответствуют текущим эпидемиологическим данным. Они представляют собой значительные ограничения, которые могут запутать интерпретацию данных и обеспечить ненадежные индексы биомаркеров. Таким образом, протокол направлен на характеристику и описание этапов стандартизированной, высоковоспроизводимой и транслируемой доклинической модели EHS у мышей, которая в значительной степени свободна от ограничений, упомянутых выше. Описаны корректировки модели, которые могут привести к дифференцированным физиологическим исходам от умеренного до смертельного теплового удара. Насколько известно авторам, это единственная доклиническая модель EHS с такими характеристиками, позволяющая проводить соответствующие исследования EHS на основе гипотез^11,17,18.

протокол

Все процедуры были рассмотрены и одобрены Университетом Флориды IACUC. Для исследования используются самцы или самки мышей C57BL/6J, возрастом ~4 месяца, весом в диапазоне 27-34 г и 20-25 г соответственно.

1. Хирургическая имплантация телеметрической системы контроля температуры

1. По прибытии от продавца позвольте животным отдохнуть в виварии не менее 1 недели до операции, чтобы свести к минимуму стресс от транспортировки.
2. Группа размещает мышей (максимум 5 на клетку в соответствии с местными рекомендациями IACUC) до дня операции по имплантации температурного телеметрического устройства. Разместите их в стандартных клетках размером 7,25 дюйма (Ш) x 11,75 дюйма (Д) x 5 дюймов (В), содержащих подстилку из кукурузных початков. Поддерживайте световой цикл на световом цикле 12 x 12 (вкл.: 7:00; выкл.: 19:00). Поддерживать температуру корпуса на уровне 20-22 °C и относительную влажность (RH) на уровне 30%-60%. Обеспечьте стандартную диету чау и воду ad libitum до протокола EHS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование индивидуального жилья заключается в том, чтобы избежать частых боевых травм у самцов мышей C57bl/6J и обеспечить широкие возможности для спонтанного запуска колес для каждой мыши.
3. Для размещения телеметрических приборов обезболивают мышь изофлураном (4%, 0,4-0,6 л/мин потока O₂₎ в индукционной камере. Затем поместите мышь под непрерывную анестезию через носовой конус (1,5%, 0,6 л/мин).
4. Используйте смазку для глаз, такую как ветеринарная мазь, чтобы защитить глаза животного от повреждений или травм во время операции.
5. Чтобы подготовить место операции, побрейте нижнюю часть живота машинками для стрижки волос мелких животных или используйте коммерчески доступное средство для удаления волос. Вводят первую дозу подкожного бупренорфина (0,1 мг/кг) в течение этого времени.
6. Очистите область тремя промывками повидона-йода (или аналогичного бактерицидного скраба) с последующим ополаскиванием 70% изопропиловым спиртом (или стерильным физиологическим раствором в зависимости от местных ветеринарных требований). Затем перенесите мышь в хирургическую область.
7. Используйте клейкую драпировку, чтобы изолировать место операции на мыши. Используя стерильные инструменты и асептическую технику, сделайте разрез ~ 1 см на средней линии вдоль linea alba, примерно в 0,5 см от реберного края. Затем отделите кожу от мышечного слоя и сделайте немного меньший разрез на linea alba, стараясь не повредить кишечник или внутренние органы.
8. Как только мышечный слой будет открыт, поместите стерильный телеметр (миниатюрное многоразовое радиотелеметрическое устройство без батареи; 16,5 х 6,5 мм) во внутрибрюшинную полость перед хвостовыми артериями и венами и дорсально к пищеварительным органам, чтобы он мог свободно плавать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все телеметры очищаются водой с мылом, тщательно промываются и стерилизуются газом с окисью этилена между использованием. Если газовая стерилизация недоступна, для дезинфекции и стерилизации телеметров допускается погружение в стерилизационные растворы (в соответствии с рекомендацией производителя по разбавлению и времени погружения).
9. Закройте брюшное отверстие стерильным рассасывающимся швом 5-0 и закройте кожу простым прерванным швом с 5-0 пролиновым швом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение телеметру плавать в брюшном отсеке, не привязывая его к брюшной стенке (метод, рекомендованный производителем), было продемонстрировано как успешное и предпочтительное авторами для устранения избыточного напряжения в брюшной стенке во время заживления. Кроме того, это не влияет на способность приемника получать сигнал от излучателя.
10. Поместите мышь в чистую клетку с переносной грелкой под клетку. Наблюдайте за мышью каждые 15 минут в течение первого часа восстановления после анестезии, а затем возвращайтесь в изолятор для животных.
11. Предоставляйте мышам подкожные инъекции бупренорфина каждые 12 ч в течение 48 ч во время восстановления и продолжайте следить за признаками дистресса. При наличии следует вводить бупренорфин с медленным высвобождением подкожно каждые 24 ч (1 мг/кг) в течение 48 ч. Позвольте мышам восстановиться в течение ~ 2 недель после операции, прежде чем вводить добровольный запуск колеса.

2. Ознакомление: Добровольный и принудительный ход колеса

1. После восстановления после операции поместите добровольные ходовые колеса в клетку для свободного доступа к колесу. Другие варианты выбора ходового колеса могут быть столь же эффективными, но убедитесь, что они вписываются в ограниченные размеры сепаратора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ходовые колеса должны были быть немного уменьшены в размерах, чтобы поместиться в стандартном сепараторе.
2. Акклиматизируйте мышь к произвольному колесу в клетке в течение 2 недель. После акклиматизации мышь готова к обучению с процедурами ознакомления с принудительными ходовыми колесами.
3. Выполните четыре тренировки (одну/день) в экологической камере при комнатной температуре (~25 °C, относительная влажность 30%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это идеально, мыши также были успешно обучены идентичным принудительным ходовым колесам вне камеры. Затем несколько мышей могут быть обучены одновременно, не мешая использованию камеры.
4. Чтобы начать первую тренировку, позвольте мыши освободить колесо в модифицированном ходовом колесе в течение 15 минут, сняв или ослабив приводной ремень двигателя, чтобы мышь могла определить скорость колеса и акклиматизироваться к нему нестрессовым образом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы могут быть запущены с помощью программного и аппаратного обеспечения, поставляемого изготовителем ходового колеса, или могут быть заменены внешним программируемым источником питания, который подключен непосредственно к колесному двигателю, что позволяет автоматизировать протокол дополнительных упражнений.
5. Откалибруйте систему для каждого ходового колеса, чтобы определить соотношение между напряжением питания и метрами в минуту (м/мин) каждого колеса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колеса принудительного хода также были модифицированы, чтобы поднять двигатель на 15 см, перевернуть и переместить шкив, приводящий колесо вниз на 5 см над платформой приемника телеметрии. Это гарантировало, что платформа приемника получала точные данные телеметрии во время работы протокола без помех со стороны двигателя.
6. После короткого периода отдыха (<5 мин) инициируйте протокол принудительного ходового колеса. Запустите колесо со скоростью 2,5 м/мин и увеличивайте 0,3 м/мин каждые 10 мин в течение 1 ч, чтобы имитировать первый час фактического испытания EHS, но при комнатной температуре. Верните мышь в ее домашнюю клетку и обеспечьте 24-часовое восстановление. Проведите следующие три сеанса принудительного бега таким же образом в последовательные дни. После 1-го дня часть акклиматизации со свободным колесом не нужна.
7. Дайте мыши 2-3 дня вымывания или восстановления от стресса принудительного бегового колеса практики, но предоставьте мыши свободный доступ к домашнему клетке добровольного колеса. Теперь мышь готова пройти протокол EHS.

3. Протокол EHS

1. В ночь перед протоколом EHS поместите мышь в камеру окружающей среды при комнатной температуре (~ 25 ° C, ≈30% относительной влажности), чтобы акклиматизироваться в камере.
2. Используйте систему сбора данных для сбора непрерывного Tc, усредненного с интервалами более 30 секунд за ночь.
3. Утром протокола EHS убедитесь, что мышь находится в нормальном диапазоне суточной температуры или ниже, прежде чем увеличивать температуру камеры (т. Е. 36-37,5 ° C). Это гарантирует, что мышь не имеет лихорадки и не испытывала чрезмерного стресса в течение этого периода.
4. Как только мышь стабилизируется и находится в пределах нормальной температуры ядра в состоянии покоя, удалите пищу и воду и взвесьте животное. Закройте дверцу камеры и увеличьте температуру камеры до целевого значения 37,5 °C и относительной влажности 40%-50% или желаемой температуры и влажности окружающей среды^19. Проверьте температуру и влажность в камере с помощью калиброванного монитора температуры и влажности.
5. Окружите камеру затемненной занавеской, чтобы свести к минимуму свет и помехи во время протокола. Непрерывно контролируйте мышь во время протокола с помощью удаленных ИК-камер. Сфокусируйте вторую камеру на мониторе температуры и влажности, расположенном близко к ходовому колесу. Внесите любые коррективы в контроллер для заданного значения камеры окружающей среды, чтобы обеспечить точные показания температуры вблизи животного.
6. Как только камера достигнет своей целевой температуры, измеренной второй камерой на мониторе температуры (это может занять ~ 30 минут), быстро откройте дверцу камеры и поместите мышь в принудительное ходовое колесо.
7. Инициируйте протокол принудительного ходового колеса со скоростью 2,5 м/мин и увеличивайте скорость на 0,3 м/мин каждые 10 мин, пока мышь не достигнет Tc 41 °C. Как только мышь достигнет этой температуры ядра, позвольте скорости оставаться постоянной до ограничения симптомов, характеризующихся очевидной потерей сознания, обратным падением или обмороком и неспособностью продолжать бежать или держаться за руль. Подтвердите этот момент времени, когда мышь имеет три оборота назад на колесе без признаков физической реакции. В качестве альтернативы можно определить гуманную конечную точку в соответствии с локальными правилами IACUC, чтобы определить, когда следует остановить протокол (например, когда Tc ~ 43 °C). Эта конечная точка немного выше ограничения симптомов практически у всех мышей.
8. Чтобы выполнить протокол быстрого охлаждения (R), как только мышь достигнет ограничения симптомов, остановите колесо и немедленно извлеките его из принудительного ходового колеса. Взвесьте мышь и поместите ее обратно в домашнюю клетку, чтобы восстановиться при комнатной температуре. В течение этого времени оставьте дверцу камеры открытой и верните установленное значение инкубатора к комнатной температуре, чтобы камера быстро остыла. Эта процедура приводит к >99% долгосрочной выживаемости.
9. Чтобы выполнить более тяжелое (S) воздействие EHS, держите домашнюю клетку животного в камере 37,5 ° C во время протокола EHS. Когда животное достигнет ограничения симптомов, позвольте ему оставаться в беговом колесе до тех пор, пока они не вернутся в сознание, как это наблюдается удаленной камерой (~ 5-9 мин).
10. Затем быстро извлеките мышь из ходового колеса и верните ее непосредственно в предварительно нагретую клетку, чтобы получить гораздо более медленный профиль охлаждения(рисунок 1A,красная пунктирная линия), по существу устраняя гипотермическую фазу EHS. В течение этого времени снимите верхнюю часть фильтра из клетки, чтобы улучшить равновесие с камерой.
11. Используйте восстановительную клетку, предварительно охлажденную до комнатной температуры, чтобы выполнить менее серьезную альтернативную процедуру, которая приведет к подавленной гипотермической фазе, но со 100% выживаемостью^20.
12. Для протокола S тщательно контролируйте мышь во время восстановления и непрерывно проверяйте наличие гуманных конечных точек. Хотя трудно удаленно проверить часто используемые гуманные конечные точки (например, корректирующий рефлекс), наблюдайте за мышами удаленно для нормальных движений во время восстановления, таких как груминг, нормальное дыхание, облизывание и т. Д. Следите за Tc в течение этого времени.
13. Мыши вряд ли выздоровеют, если температура их ядра изменит направление во время фазы восстановления, в конечном итоге превысив 40 ° C; в это время завершите эксперимент и оцените мышь на предмет стандартных гуманных конечных точек.

Результаты

Типичные профили терморегуляции в течение всего протокола EHS и раннего восстановления мыши проиллюстрированы на рисунке 1A. Этот профиль содержит четыре различные фазы, которые могут быть определены как стадия нагрева камеры, стадия инкрементного упражнения, стадия ст?...

Обсуждение

Этот технический обзор направлен на предоставление рекомендаций по производительности доклинической модели EHS у мышей. Приведены подробные шаги и материалы, необходимые для выполнения воспроизводимого эпизода EHS различной степени тяжести. Важно отметить, что модель в значительной ст...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.