Um modelo pré-clínico de insolação exercional em camundongos

Resumo

O protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo padronizado, repetível e pré-clínico de insolação exercional (EHS) em camundongos livres de estímulos externos adversos, como choque elétrico. O modelo fornece uma plataforma para estudos mecanicistas, preventivos e terapêuticos.

Resumo

O insolação é a manifestação mais severa de doenças relacionadas ao calor. A insolação clássica (CHS), também conhecida como insolação passiva, ocorre em repouso, enquanto a insolação exercional (EHS) ocorre durante a atividade física. EHS difere do CHS em etiologia, apresentação clínica e sequelas de disfunção multi-órgãos. Até recentemente, apenas modelos de CHS foram bem estabelecidos. Este protocolo visa fornecer diretrizes para um modelo de mouse pré-clínico refinado de EHS que esteja livre de fatores limitantes importantes, como o uso de anestesia, contenção, sondas retais ou choque elétrico. Camundongos C57Bl/6 machos e fêmeas, instrumentados com sondas telemétricas de temperatura do núcleo (Tc) foram utilizados neste modelo. Para a familiarização com o modo de corrida, os ratos passam por 3 semanas de treinamento usando rodas de corrida voluntárias e forçadas. Depois disso, os ratos correm em uma roda forçada dentro de uma câmara climática fixada em 37,5 °C e 40%-50% de umidade relativa (RH) até apresentar limitação dos sintomas (por exemplo, perda de consciência) em Tc de 42,1-42,5 °C, embora os resultados adequados possam ser obtidos a temperaturas de câmara entre 34,5-39,5 °C e umidade entre 30%-90%. Dependendo da gravidade desejada, os camundongos são removidos da câmara imediatamente para recuperação em temperatura ambiente ou permanecem na câmara aquecida por uma duração mais longa, induzindo uma exposição mais grave e uma maior incidência de mortalidade. Os resultados são comparados com controles de exercício (EXC) e/ou controles ingênuos (NC). O modelo espelha muitos dos desfechos fisiofisiológicos observados na EHS humana, incluindo perda de consciência, hipertermia grave, danos multi-órgãos, bem como liberação inflamatória de citocinas, e respostas de fase aguda do sistema imunológico. Este modelo é ideal para pesquisas orientadas a hipóteses para testar estratégias preventivas e terapêuticas que possam retardar o surgimento da EHS ou reduzir o dano multi-órgão que caracteriza essa manifestação.

Introdução

A insolação é caracterizada por disfunção do sistema nervoso central e danos subsequentes aos órgãos em indivíduos hipertérmicos¹. Há duas manifestações de insolação. A insolação clássica (CHS) afeta principalmente populações idosas durante ondas de calor ou crianças deixadas em veículos expostos ao sol durante os dias quentes de verão¹. O insolação exercional (EHS) ocorre quando há uma incapacidade de termregular adequadamente durante o esforço físico, tipicamente, mas nem sempre, sob altas temperaturas ambientais resultando em sintomas neurológicos, hipertermia e subsequente disfunção multi-órgãos e danos². EHS ocorre em atletas recreativos e de elite, bem como militares e trabalhadores com e sem desidratação concomitante^3,4. De fato, a EHS é a terceira principal causa de mortalidade em atletas durante a atividade física⁵. É extremamente desafiador estudar eHS em humanos, pois o episódio pode ser letal ou levar a desfechos negativos de saúde a longo prazo^6,7. Portanto, um modelo pré-clínico confiável de EHS poderia servir como uma ferramenta valiosa para superar as limitações das observações clínicas retrospectivas e associativas em vítimas humanas de EHS. Modelos pré-clínicos de CHS em roedores e suínos têm sido bem caracterizados^8,9,10. No entanto, modelos pré-clínicos de CHS não se traduzem diretamente na fisiopatologia EHS devido aos efeitos únicos do exercício físico no perfil termoregulatório e resposta imune inata¹¹. Além disso, tentativas anteriores de desenvolver modelos de EHS pré-clínicos em roedores apresentaram restrições significativas, incluindo estímulos de estresse sobrepostos induzidos por choque elétrico, inserção de uma sonda retatal e temperaturas corporais máximas predefinidas com altas taxas de mortalidade^{12,13,14,15,16} que não correspondem aos dados epidemiológicos atuais. Isso representa limitações significativas que podem confundir a interpretação dos dados e fornecer índices biomarcadores não confiáveis. Portanto, o protocolo visa caracterizar e descrever os passos de um modelo préclínico padronizado, altamente repetível e translacionável de EHS em camundongos que está em grande parte livre das limitações mencionadas acima. São descritos ajustes no modelo que podem resultar em desfechos fisiológicos classificados de insolação moderada a fatal. Para o conhecimento dos autores, este é o único modelo pré-clínico da EHS com tais características, possibilitando a busca de pesquisas relevantes de EHS de forma orientada a hipóteses^11,17,18.

Protocolo

Todos os procedimentos foram revisados e aprovados pela Universidade da Flórida IACUC. C57BL/6J camundongos machos ou fêmeas, ~4 meses de idade, pesando dentro de uma faixa de 27-34 g e 20-25 g, respectivamente, são usados para o estudo.

1. Implantação cirúrgica do sistema de monitoramento de temperatura telemétrica

1. Ao chegar do vendedor, deixe os animais descansarem no vivarium por pelo menos 1 semana antes da cirurgia para minimizar o estresse do transporte.
2. Grupo abriga os camundongos (máximo de 5 por gaiola sob as diretrizes locais do IACUC) até o dia da cirurgia para implantação de dispositivo telemétrico de temperatura. Abriga-os nas gaiolas padrão de 7,25" (W) x 11,75" (L) x 5" (H) contendo cama de corncob. Mantenha o ciclo de luz em um ciclo de luz de 12 x 12 (ligado: 7:00; desligado: 7 PM). Mantenha a temperatura da habitação em 20-22 °C e a umidade relativa do ar (RH) em 30%-60%. Forneça a dieta padrão de chow e o anúncio de água libitum até o protocolo EHS.
   NOTA: A lógica para a habitação individual é evitar lesões de combate frequentes em camundongos C57bl/6J masculinos e proporcionar ampla oportunidade para a corrida espontânea da roda para cada rato.
3. Para a colocação dos dispositivos de telemetria, anestesia o mouse com isoflurano (4%, 0,4-0,6 L/min de fluxo O₂₎ em uma câmara de indução. Em seguida, coloque o rato sob anestesia contínua através de um cone de nariz (1,5%, 0,6 L/min).
4. Use lubrificante ocular, como uma pomada veterinária, para proteger os olhos do animal de danos ou lesões durante a cirurgia.
5. Para preparar o local cirúrgico, raspe o abdômen inferior com pequenos cortadores de cabelo animal ou use um removedor de cabelo comercialmente disponível. Administre a primeira dose de buprenorfina subcutânea (0,1 mg/kg) durante este período.
6. Esfregue a área com três lavagens de povidone-iodo (ou esfoliação germicida similar) seguida de 70% de enxaguagem de álcool isopropílico (ou soro fisiológico estéril, dependendo das necessidades veterinárias locais). Em seguida, transfira o rato para a área cirúrgica.
7. Use uma cortina adesiva para isolar o local cirúrgico no mouse. Usando instrumentos estéreis e técnica asséptica, faça uma incisão de ~1 cm na linha média ao longo da linha alba, cerca de 0,5 cm da margem costeira. Em seguida, separe a pele da camada muscular e faça uma incisão um pouco menor na linha alba, cuidado para não danificar as entranhas ou órgãos internos.
8. Uma vez aberta a camada muscular, coloque o telemetro estéril (dispositivo de radiotelememetria reutilizável em miniatura livre de bateria; 16,5 x 6,5 mm) na cavidade intraperitoneal em frente às artérias e veias caudais e dorsal aos órgãos digestivos para permitir que ele flutue livremente.
   NOTA: Todos os telemetros são limpos com água e sabão, completamente enxaguados e gás esterilizado com óxido de etileno entre os usos. Se a esterilização a gás não estiver disponível, a imersão em soluções de esterilização (seguindo a recomendação do fabricante para diluição e tempo de imersão) é aceita para desinfetar e esterilizar os telemetros.
9. Feche a abertura abdominal com uma sutura absorvível estéril de 5-0, e feche a pele usando um simples ponto interrompido com sutura de prolina 5-0.
   NOTA: Permitir que o telemetro flutue no compartimento abdominal sem mossá-lo à parede abdominal (método recomendado pelo fabricante) foi demonstrado ser bem sucedido e preferido pelos autores para eliminar o excesso de tensão na parede abdominal durante a cicatrização. Além disso, isso não tem impacto na capacidade do receptor de obter o sinal do emissor.
10. Coloque o mouse em sua gaiola limpa com uma almofada de aquecimento portátil sob a gaiola. Monitore o rato a cada 15 minutos durante a primeira hora de recuperação da anestesia e, em seguida, retorne ao centro de alojamento de animais.
11. Forneça aos camundongos injeções de buprenorfina subcutânea a cada 12 h durante a recuperação e continue monitorando sinais de angústia. Se disponível, dê buprenorfina de liberação lenta subcutânea a cada 24 horas (1 mg/kg) por 48 h. Permita que os ratos se recuperem por ~2 semanas após a cirurgia antes de introduzir uma roda voluntária de corrida.

2. Familiarização: Corrida voluntária e forçada da roda

1. Após a recuperação da cirurgia, coloque as rodas de corrida voluntárias na gaiola para acesso gratuito ao volante. Outras seleções de rodas em execução podem ser igualmente eficazes, mas certifique-se de que se encaixa dentro dos tamanhos limitados da gaiola disponíveis.
   NOTA: As rodas de corrida tiveram que ser ligeiramente reduzidas em dimensão para caber em uma gaiola padrão.
2. Aclimes o rato para a roda voluntária na gaiola por 2 semanas. Uma vez aclimatado, o mouse está pronto para treinamento com procedimentos de familiarização para as rodas de corrida forçadas.
3. Realizar as quatro sessões de treinamento (um/dia) na câmara ambiental à temperatura ambiente (~25 °C, 30% de umidade relativa).
   NOTA: Embora isso seja ideal, os ratos também foram treinados com sucesso em rodas forçadas idênticas fora da câmara. Vários ratos podem então ser treinados simultaneamente sem interferir no uso da câmara.
4. Para iniciar a primeira sessão de treinamento, deixe o mouse liberar a roda na roda de corrida modificada por 15 minutos, removendo ou afrouxando a correia do motor para permitir que o mouse determine a velocidade da roda e aclimate-o de forma não estressante.
   NOTA: Os protocolos podem ser executados com software e hardware fornecidos pelo fabricante da roda em execução ou podem ser substituídos por uma fonte de alimentação programável externa que é conectada diretamente ao motor da roda, o que permite a automação do protocolo de exercício incremental.
5. Calibrar o sistema para cada roda em funcionamento para determinar a relação entre a tensão de alimentação e os medidores/minutos (m/min) de cada roda.
   NOTA: As rodas de corrida forçadas também foram modificadas para elevar o motor de 15 cm, inverter e mover a polia que conduz a roda até 5 cm acima da plataforma receptora de telemetria. Isso garantiu que a plataforma receptora obteve dados precisos de telemetria durante o protocolo de funcionamento sem interferência do motor.
6. Após um breve período de descanso (<5 min), inicie o protocolo de roda de corrida forçada. Inicie a roda a 2,5 m/min e aumente 0,3 m/min a cada 10 minutos para um total de 1h para imitar a primeira hora do ensaio ehs real, mas em temperatura ambiente. Devolva o mouse para sua gaiola doméstica e permita a recuperação de 24 horas. Realizar as três sessões de execução forçadas subsequentes da mesma forma em dias consecutivos. Após o primeiro dia, a parte de aclimatação de rodas livres é desnecessária.
7. Deixe o mouse de 2-3 dias de lavagem ou recuperação do estresse da prática forçada da roda de corrida, mas permita ao mouse acesso livre à roda voluntária da gaiola doméstica. O mouse está preparado para se submeter ao protocolo EHS.

3. Protocolo EHS

1. Na noite anterior ao protocolo EHS, coloque o rato na câmara ambiental em temperatura ambiente (~25 °C, ≈30% de umidade relativa) para se aclimatar à câmara.
2. Use um sistema de aquisição de dados para coletar Tc contínuo, com média de intervalos de 30 s durante a noite.
3. Na manhã do protocolo EHS, certifique-se de que o mouse esteja a uma faixa normal de temperatura diurna antes de aumentar a temperatura da câmara (ou seja, 36-37,5 °C). Isso garante que o camundongo não tenha febre e não tenha experimentado estresse indevido durante este período.
4. Uma vez que o rato esteja estável e dentro de uma faixa de temperatura normal do núcleo de repouso, remova a comida e a água e pese o animal. Feche a porta da câmara e aumente a temperatura da câmara para uma meta de 37,5 °C e 40%-50% de umidade relativa, ou a temperatura ambiental desejada e umidade¹⁹. Verifique a temperatura e a umidade da câmara com um monitor de temperatura e umidade calibrado.
5. Cerque a câmara com uma cortina apagada para manter a luz e os distúrbios mínimos durante o protocolo. Monitore o mouse continuamente durante o protocolo através de câmeras remotas iluminadas por RI. Concentre uma segunda câmera no monitor de temperatura e umidade, colocado perto da roda de corrida. Faça quaisquer ajustes no controlador para o ponto de ajuste da câmara ambiental para garantir leituras precisas de temperatura perto do animal.
6. Uma vez que a câmara tenha atingido sua temperatura alvo medida pela segunda câmera no monitor de temperatura (isso pode levar ~30 min), abrir rapidamente a porta da câmara e colocar o mouse na roda de corrida forçada.
7. Inicie o protocolo de roda de corrida forçada a uma velocidade de 2,5 m/min e aumente a velocidade de 0,3 m/min a cada 10 minutos até que o mouse atinja um Tc de 41 °C. Uma vez que o mouse tenha atingido esta temperatura do núcleo, permita que a velocidade permaneça constante até a limitação do sintoma, caracterizada por uma aparente perda de consciência, uma queda ou desmaio para trás, e a incapacidade de continuar a correr ou segurar a roda. Confirme este ponto de tempo quando o mouse tem três rotações para trás na roda sem sinais de resposta física. Alternativamente, identifique um ponto final humano seguindo as regras locais da IACUC para determinar quando parar o protocolo (por exemplo, quando Tc ~43 °C). Este ponto final é ligeiramente acima da limitação dos sintomas em essencialmente todos os camundongos.
8. Para executar o protocolo de resfriamento rápido (R), uma vez que o mouse atinja a limitação dos sintomas, pare a roda e remova-a imediatamente da roda de corrida forçada. Pesar o rato e colocá-lo de volta em sua gaiola para se recuperar à temperatura ambiente. Durante esse tempo, deixe a porta da câmara aberta e devolva o ponto de configuração da incubadora à temperatura ambiente para permitir que a câmara esfrie rapidamente. Este procedimento resulta em >99% de sobrevivência a longo prazo.
9. Para realizar uma exposição mais grave (S) EHS, mantenha a gaiola doméstica do animal dentro da câmara de 37,5 °C durante o protocolo EHS. Quando o animal atingir a limitação dos sintomas, permita que permaneçam na roda de corrida até que retornem à consciência, como observado pela câmera remota (~5-9 min).
10. Em seguida, remova rapidamente o mouse da roda de corrida e devolva-o diretamente à sua gaiola pré-aquecida para resultar em um perfil de resfriamento muito mais lento(Figura 1A, linha tracejada vermelha), essencialmente eliminando a fase hipotérmica EHS. Remova a parte superior do filtro da gaiola durante este período para melhorar o equilíbrio com a câmara.
11. Use uma gaiola de recuperação pré-adaptada à temperatura ambiente para realizar um procedimento alternativo menos grave para resultar em uma fase hipotérmica suprimida, mas com uma taxa de sobrevivência de^{100% 20}.
12. Para o protocolo S, monitore cuidadosamente o mouse durante a recuperação e verifique continuamente se há pontos finais humanos. Embora seja difícil testar remotamente pontos finais humanos comumente usados (por exemplo, reflexo de retardo), observe os ratos remotamente para movimentos normais durante a recuperação, como aliciamento, respiração normal, lambida, etc. Monitore o Tc durante este tempo.
13. É improvável que os camundongos se recuperem se a temperatura do núcleo inverter a direção durante a fase de recuperação, eventualmente excedendo 40 °C; neste momento, encerre o experimento e avalie o mouse para pontos finais humanos padrão.

Resultados

Os perfis termoregulatórios típicos durante a totalidade do protocolo EHS e a recuperação antecipada de um mouse são ilustrados na Figura 1A. Este perfil compreende quatro fases distintas que podem ser definidas como o estágio de aquecimento da câmara, estágio de exercício incremental, estágio de exercício de estado estável e um estágio de recuperação por um método de resfriamento rápido (R) ou grave (S)¹⁷. Os principais desfechos termoregulatórios i...

Discussão

Esta revisão técnica visa fornecer diretrizes para o desempenho de um modelo pré-clínico de EHS em camundongos. São fornecidas etapas e materiais detalhados necessários para a execução de um episódio de EHS reprodutível de gravidades variáveis. É importante ressaltar que o modelo imita em grande parte os sinais, sintomas e disfunção multi-órgãos observados em vítimas humanas de EHS^11,19. Além disso, este modelo permite o exame do mecanismo subja...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.