Ein präklinisches Modell des Belastungshitzeinschlags bei Mäusen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, wiederholbaren, präklinischen Modells des Belastungshitzschlags (EHS) bei Mäusen, die frei von nachteiligen äußeren Reizen wie Elektroschocks sind. Das Modell bietet eine Plattform für mechanistische, präventive und therapeutische Studien.

Zusammenfassung

Hitzschlag ist die schwerste Manifestation von hitzebedingten Erkrankungen. Klassischer Hitzschlag (CHS), auch bekannt als passiver Hitzschlag, tritt in Ruhe auf, während exertional hitzschlag (EHS) während körperlicher Aktivität auftritt. EHS unterscheidet sich von CHS in Ätiologie, klinischer Präsentation und Folgeerscheinungen von Multiorgan-Dysfunktion. Bis vor kurzem waren nur Modelle von CHS gut etabliert. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Richtlinien für ein verfeinertes präklinisches Mausmodell von EHS bereitzustellen, das frei von wichtigen einschränkenden Faktoren wie der Verwendung von Anästhesie, Zurückhaltung, rektalen Sonden oder Elektrischem Schlag ist. Männliche und weibliche C57Bl/6-Mäuse, die mit telemetrischen Kerntemperatursonden (Tc) instrumentiert wurden, wurden in diesem Modell verwendet. Um sich mit dem Laufmodus vertraut zu machen, durchlaufen Mäuse ein 3-wöchiges Training mit freiwilligen und erzwungenen Laufrädern. Danach laufen Mäuse auf einem erzwungenen Rad in einer Klimakammer, die auf 37,5 °C und 40%-50% relative Luftfeuchtigkeit (RH) eingestellt ist, bis sie eine Symptombegrenzung (z. B. Bewusstlosigkeit) bei Tc von 42,1-42,5 °C zeigen, obwohl bei Kammertemperaturen zwischen 34,5-39,5 °C und einer Luftfeuchtigkeit zwischen 30%-90% geeignete Ergebnisse erzielt werden können. Abhängig von der gewünschten Schwere werden Mäuse sofort aus der Kammer entfernt, um sich bei Umgebungstemperatur zu erholen, oder bleiben länger in der beheizten Kammer, was zu einer schwereren Exposition und einer höheren Mortalitätsrate führt. Die Ergebnisse werden mit scheingepassten Übungskontrollen (EXC) und/oder naiven Kontrollen (NC) verglichen. Das Modell spiegelt viele der pathophysiologischen Ergebnisse wider, die bei menschlichen EHS beobachtet wurden, einschließlich Bewusstlosigkeit, schwerer Hyperthermie, Multiorganschäden sowie entzündlicher Zytokinfreisetzung und akuter Phasenreaktionen des Immunsystems. Dieses Modell ist ideal für die hypothesengetriebene Forschung, um präventive und therapeutische Strategien zu testen, die den Beginn von EHS verzögern oder den Multiorganschaden reduzieren können, der diese Manifestation charakterisiert.

Einleitung

Hitzschlag ist gekennzeichnet durch dysfunktion des zentralen Nervensystems und nachfolgende Organschäden bei hyperthermen Probanden¹. Es gibt zwei Manifestationen von Hitzschlag. Der klassische Hitzschlag (CHS) betrifft vor allem ältere Bevölkerungsgruppen während Hitzewellen oder Kinder, die an heißen Sommertagen in sonnenexponierten Fahrzeugen zurückgelassen werden¹. Ein Belastungshitzschlag (EHS) tritt auf, wenn es nicht möglich ist, während körperlicher Anstrengung angemessen zu thermoregulieren, typischerweise, aber nicht immer, unter hohen Umgebungstemperaturen, was zu neurologischen Symptomen, Hyperthermie und anschließender Multiorganfunktionsstörung und^-schädigungführt 2 . EHS tritt bei Freizeit- und Spitzensportlern sowie Militärpersonal und bei Arbeitern mit und ohne gleichzeitige Dehydrierung^{auf 3,4}. Tatsächlich ist EHS die dritthäufigste Todesursache bei Sportlern bei körperlicher Aktivität⁵. Es ist äußerst schwierig, EHS beim Menschen zu untersuchen, da die Episode tödlich sein oder zu langfristigen negativen gesundheitlichen Folgen führen kann^6,7. Daher könnte ein zuverlässiges präklinisches Modell von EHS als wertvolles Instrument dienen, um die Einschränkungen retrospektiver und assoziativer klinischer Beobachtungen bei menschlichen EHS-Opfern zu überwinden. Präklinische Modelle von CHS bei Nagetieren und Schweinen wurden gut charakterisiert^8,9,10. Präklinische Modelle von CHS übersetzen sich jedoch aufgrund der einzigartigen Auswirkungen körperlicher Bewegung auf das thermoregulatorische Profil und die angeborene Immunantwort nicht direkt in die EHS-Pathophysiologie¹¹. Darüber hinaus stellten frühere Versuche, präklinische EHS-Modelle bei Nagetieren zu entwickeln, erhebliche Einschränkungen dar, darunter überlagerte Stressreize, die durch elektrischen Schlag induziert wurden, das Einsetzen einer rektalen Sonde und vordefinierte maximale Körperkerntemperaturen mit hohen^{Mortalitätsraten 12,13,14,15,16} die nicht mit den aktuellen epidemiologischen Daten übereinstimmen. Dies stellen erhebliche Einschränkungen dar, die die Dateninterpretation stören und unzuverlässige Biomarker-Indizes liefern können. Daher zielt das Protokoll darauf ab, die Schritte eines standardisierten, hochgradig wiederholbaren und übersetzbaren präklinischen Modells von EHS in Mäusen zu charakterisieren und zu beschreiben, das weitgehend frei von den oben genannten Einschränkungen ist. Anpassungen des Modells, die zu abgestuften physiologischen Ergebnissen von einem mittelschweren bis zu einem tödlichen Hitzschlag führen können, werden beschrieben. Nach Kenntnis der Autoren ist dies das einzige präklinische EHS-Modell mit solchen Eigenschaften, das es ermöglicht, relevante EHS-Forschung hypothesengetrieben zu betreiben^11,17,18.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der University of Florida IACUC überprüft und genehmigt. C57BL/6J männliche oder weibliche Mäuse, ~4 Monate alt, mit einem Gewicht von 27-34 g bzw. 20-25 g, werden für die Studie verwendet.

1. Chirurgische Implantation des telemetrischen Temperaturüberwachungssystems

1. Lassen Sie die Tiere bei der Ankunft vom Verkäufer mindestens 1 Woche vor der Operation im Vivarium ruhen, um den Transportstress zu minimieren.
2. Gruppen beherbergen die Mäuse (maximal 5 pro Käfig nach lokalen IACUC-Richtlinien) bis zum Tag der Operation für die Implantation von Temperaturtelemetriegeräten. Bringen Sie sie in Standardkäfigen mit 7,25 "(B) x 11,75" (L) x 5" (H) unter, die Maiskolbenbettung enthalten. Halten Sie den Lichtzyklus auf einem 12 x 12-Lichtzyklus (Ein: 7 Uhr; Aus: 19 Uhr) aufrecht. Halten Sie die Gehäusetemperatur bei 20-22 °C und die relative Luftfeuchtigkeit (RH) bei 30%-60%. Stellen Sie die Standard-Chow-Diät und Wasser ad libitum bis zum EHS-Protokoll zur Verfügung.
   HINWEIS: Die Begründung für die individuelle Unterbringung besteht darin, häufige Kampfverletzungen bei männlichen C57bl/6J-Mäusen zu vermeiden und jeder Maus ausreichend Gelegenheit für spontane Radläufe zu bieten.
3. Zur Platzierung der Telemetriegeräte wird die Maus mit Isofluran (4%, 0,4-0,6 l/min_{O2-Durchfluss)} in einer Induktionskammer betäubt. Anschließend wird die Maus über einen Nasenkegel (1,5 %, 0,6 l/min) unter Daueranästhesie gestellt.
4. Verwenden Sie Augengleitmittel, wie z. B. eine Tiersalbe, um die Augen des Tieres vor Schäden oder Verletzungen während der Operation zu schützen.
5. Um die Operationsstelle vorzubereiten, rasieren Sie den Unterbauch mit kleinen Tierhaarschneidern oder verwenden Sie einen handelsüblichen Haarentferner. Verabreichen Sie während dieser Zeit die erste Dosis subkutanes Buprenorphin (0,1 mg/kg).
6. Schrubben Sie den Bereich mit drei Waschungen Povidon-Jod (oder einem ähnlichen keimtötenden Peeling), gefolgt von einer 70% igen Isopropylalkoholspülung (oder sterile Kochsalzlösung je nach lokalen veterinärmedizinischen Anforderungen). Übertragen Sie dann die Maus in den Operationsbereich.
7. Verwenden Sie einen Klebevorhang, um die Operationsstelle an der Maus zu isolieren. Machen Sie mit sterilen Instrumenten und aseptischer Technik einen ~ 1 cm langen Schnitt auf der Mittellinie entlang der Linea alba, etwa 0,5 cm vom Rippenrand entfernt. Trennen Sie dann die Haut von der Muskelschicht und machen Sie einen etwas kleineren Schnitt an der Linea alba, achten Sie darauf, den Darm oder die inneren Organe nicht zu beschädigen.
8. Sobald die Muskelschicht geöffnet ist, platzieren Sie das sterile Telemeter (Miniatur-wiederverwendbares batterieloses Radiotelemetriegerät; 16,5 x 6,5 mm) in die intraperitoneale Höhle vor den Schwanzadern und Venen und dorsal zu den Verdauungsorganen, damit es frei schweben kann.
   HINWEIS: Alle Telemeter werden mit Wasser und Seife gereinigt, gründlich gespült und zwischen den Anwendungen mit Ethylenoxid gassterilisiert. Wenn keine Gassterilisation verfügbar ist, wird das Eintauchen in Sterilisationslösungen (gemäß der Empfehlung des Herstellers für Verdünnung und Tauchzeit) akzeptiert, um die Telemeter zu desinfizieren und zu sterilisieren.
9. Schließen Sie die Bauchöffnung mit einer sterilen 5-0 resorbierbaren Naht und schließen Sie die Haut mit einem einfachen unterbrochenen Stich mit 5-0 Prolinnaht.
   HINWEIS: Das Telemeter im Bauchraum schweben zu lassen, ohne es an die Bauchdecke zu binden (eine vom Hersteller empfohlene Methode), hat sich als erfolgreich erwiesen und von den Autoren bevorzugt, um übermäßige Spannungen in der Bauchdecke während der Heilung zu beseitigen. Darüber hinaus hat dies keinen Einfluss auf die Fähigkeit des Empfängers, das Signal vom Sender zu erhalten.
10. Legen Sie die Maus in ihren sauberen Käfig mit einem tragbaren Heizkissen unter dem Käfig. Überwachen Sie die Maus alle 15 Minuten während der ersten Stunde der Genesung von der Narkose und kehren Sie dann in die Tierhaltung zurück.
11. Versorgen Sie Mäuse während der Genesung alle 12 h für 48 h mit subkutanen Buprenorphin-Injektionen und überwachen Sie weiterhin auf Anzeichen von Stress. Falls verfügbar, langsam freisetzendes Buprenorphin subkutan alle 24 h (1 mg/kg) für 48 h geben. Lassen Sie die Mäuse sich nach der Operation für ~ 2 Wochen erholen, bevor Sie einen freiwilligen Radlauf einführen.

2. Eingewöhnung: Freiwilliges und erzwungenes Laufen der Räder

1. Stellen Sie nach der Genesung von der Operation die freiwillig laufenden Räder in den Käfig, um freien Zugang zum Rad zu erhalten. Andere Laufradauswahlen können ebenso effektiv sein, aber stellen Sie sicher, dass sie in die begrenzten verfügbaren Käfiggrößen passen.
   HINWEIS: Die Laufräder mussten in den Abmessungen leicht reduziert werden, um in einen Standardkäfig zu passen.
2. Akklimatisieren Sie die Maus für 2 Wochen an das freiwillige Rad im Käfig. Einmal akklimatisiert, ist die Maus bereit für das Training mit Einarbeitungsverfahren für die zwangsläufigen Laufräder.
3. Führen Sie die vier Trainingseinheiten (eins/Tag) in der Umgebungskammer bei Raumtemperatur (~25 °C, 30% relative Luftfeuchtigkeit) durch.
   HINWEIS: Obwohl dies ideal ist, wurden Mäuse auch erfolgreich in identischen Zwangslaufrädern außerhalb der Kammer trainiert. Mehrere Mäuse können dann gleichzeitig trainiert werden, ohne die Nutzung der Kammer zu beeinträchtigen.
4. Um die erste Trainingseinheit zu beginnen, lassen Sie die Maus 15 Minuten lang im modifizierten Laufrad freilaufen, indem Sie den Motorantriebsriemen entfernen oder lösen, damit die Maus die Geschwindigkeit des Rades bestimmen und sich nicht stressig daran gewöhnen kann.
   HINWEIS: Protokolle können mit Software und Hardware ausgeführt werden, die vom Laufradhersteller bereitgestellt werden, oder sie können durch ein externes programmierbares Netzteil ersetzt werden, das direkt mit dem Radmotor verbunden ist, was die Automatisierung des inkrementellen Übungsprotokolls ermöglicht.
5. Kalibrieren Sie das System für jedes Laufrad, um das Verhältnis zwischen der Versorgungsspannung und den Metern/Minuten (m/min) jedes Rades zu bestimmen.
   HINWEIS: Die erzwungenen Laufräder wurden ebenfalls modifiziert, um den Motor um 15 cm anzuheben, umzukehren und die Riemenscheibe, die das Rad antreibt, auf 5 cm über der Telemetrieempfängerplattform zu bewegen. Dies stellte sicher, dass die Empfängerplattform während des laufenden Protokolls genaue Telemetriedaten ohne Störungen durch den Motor erhielt.
6. Nach einer kurzen Ruhezeit (<5 min) leiten Sie das Zwangslaufradprotokoll ein. Starten Sie das Rad mit 2,5 m/min und erhöhen Sie es alle 10 min um 0,3 m/min für insgesamt 1 h, um die erste Stunde des eigentlichen EHS-Versuchs nachzuahmen, jedoch bei Raumtemperatur. Bringen Sie die Maus in ihren Heimkäfig zurück und ermöglichen Sie eine 24-stündige Wiederherstellung. Führen Sie die folgenden drei erzwungenen Laufsitzungen an aufeinanderfolgenden Tagen auf die gleiche Weise durch. Nach Tag 1 entfällt der freilaufende Akklimatisierungsteil.
7. Erlauben Sie der Maus 2-3 Tage auswaschen oder sich vom Stress der erzwungenen Laufradübung erholen, aber erlauben Sie der Maus freien Zugang zum freiwilligen Heimkäfigrad. Die Maus ist nun darauf vorbereitet, das EHS-Protokoll zu durchlaufen.

3. EHS-Protokoll

1. Stellen Sie die Maus in der Nacht vor dem EHS-Protokoll bei Raumtemperatur (~ 25 °C, ≈30% relative Luftfeuchtigkeit) in die Umgebungskammer, um sich an die Kammer zu gewöhnen.
2. Verwenden Sie ein Datenerfassungssystem, um kontinuierliche Tc zu sammeln, gemittelt über 30-s-Intervalle über Nacht.
3. Stellen Sie am Morgen des EHS-Protokolls sicher, dass sich die Maus auf oder unter einem normalen Bereich der Tagestemperatur befindet, bevor Sie die Kammertemperatur erhöhen (d. h. 36-37,5 ° C). Dies stellt sicher, dass die Maus kein Fieber hat und während dieser Zeit keinen übermäßigen Stress erlebt hat.
4. Sobald die Maus stabil ist und sich in einem Bereich der normalen Ruhekerntemperatur befindet, entfernen Sie das Futter und das Wasser und wiegen Sie das Tier. Schließen Sie die Kammertür und erhöhen Sie die Kammertemperatur auf ein Ziel von 37,5 ° C und 40% -50% relativer Luftfeuchtigkeit oder die gewünschte Umgebungstemperatur und^{Luftfeuchtigkeit 19}. Überprüfen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit der Kammer mit einem kalibrierten Temperatur- und Feuchtigkeitsmonitor.
5. Umgeben Sie die Kammer mit einem Verdunklungsvorhang, um Licht und Störungen während des Protokolls minimal zu halten. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich während des Protokolls über IR-beleuchtete Remote-Kameras. Richten Sie eine zweite Kamera auf den Temperatur- und Feuchtigkeitsmonitor, der sich in der Nähe des Laufrads befindet. Nehmen Sie alle Anpassungen am Regler für den Sollwert der Umgebungskammer vor, um genaue Temperaturmessungen in der Nähe des Tieres zu gewährleisten.
6. Sobald die Kammer ihre Zieltemperatur erreicht hat, die von der zweiten Kamera auf dem Temperaturwächter gemessen wurde (dies kann ~30 min dauern), öffnen Sie schnell die Kammertür und legen Sie die Maus in das erzwungene Laufrad.
7. Initiieren Sie das erzwungene Laufradprotokoll mit einer Geschwindigkeit von 2,5 m/min und erhöhen Sie die Geschwindigkeit alle 10 minuten um 0,3 m/min, bis die Maus einen Tc von 41 °C erreicht. Sobald die Maus diese Kerntemperatur erreicht hat, lassen Sie die Geschwindigkeit bis zur Symptombegrenzung konstant bleiben, gekennzeichnet durch einen offensichtlichen Bewusstlosigkeitsverlust, einen Rückwärtssturz oder Ohnmacht und die Unfähigkeit, weiter zu laufen oder sich am Rad festzuhalten. Bestätigen Sie diesen Zeitpunkt, wenn die Maus drei Rückwärtsumdrehungen auf dem Rad hat, ohne Anzeichen einer physischen Reaktion. Alternativ können Sie einen humanen Endpunkt gemäß den lokalen IACUC-Regeln identifizieren, um zu bestimmen, wann das Protokoll gestoppt werden muss (z. B. wenn Tc ~ 43 ° C). Dieser Endpunkt liegt bei praktisch allen Mäusen leicht über der Symptombegrenzung.
8. Um das Rapid Cooling-Protokoll (R) auszuführen, stoppen Sie das Rad, sobald die Maus die Symptombegrenzung erreicht hat, und entfernen Sie es sofort vom erzwungenen Laufrad. Wiegen Sie die Maus und legen Sie sie zurück in ihren Heimkäfig, um sich bei Raumtemperatur zu erholen. Lassen Sie während dieser Zeit die Kammertür offen und bringen Sie den Inkubator-Sollwert auf Raumtemperatur zurück, damit die Kammer schnell abkühlen kann. Dieses Verfahren führt zu >99% Langzeitüberleben.
9. Um eine schwerere (S) EHS-Exposition durchzuführen, halten Sie den Heimkäfig des Tieres während des EHS-Protokolls in der 37,5 °C-Kammer. Wenn das Tier die Symptombegrenzung erreicht, lassen Sie es im Laufrad bleiben, bis es zu Bewusstsein zurückkehrt, wie von der Fernkamera beobachtet (~ 5-9 min).
10. Entfernen Sie dann schnell die Maus vom Laufrad und bringen Sie sie direkt in ihren vorgewärmten Käfig zurück, um ein viel langsameres Kühlprofil zu erhalten(Abbildung 1A,rote gestrichelte Linie), wodurch die ehS-hypotherme Phase im Wesentlichen eliminiert wird. Entfernen Sie während dieser Zeit die Filteroberseite aus dem Käfig, um das Gleichgewicht mit der Kammer zu verbessern.
11. Verwenden Sie einen auf Raumtemperatur vorgekühlten Erholungskäfig, um ein weniger schweres alternatives Verfahren durchzuführen, das zu einer unterdrückten hypothermen Phase führt, jedoch mit einer Überlebensrate von 100%²⁰.
12. Überwachen Sie für das S-Protokoll die Maus während der Wiederherstellung sorgfältig und überprüfen Sie kontinuierlich auf humane Endpunkte. Obwohl es schwierig ist, aus der Ferne auf häufig verwendete humane Endpunkte (z. B. Aufrichtungsreflex) zu testen, beobachten Sie die Mäuse aus der Ferne auf normale Bewegungen während der Genesung wie Pflege, normale Atmung, Lecken usw. Überwachen Sie den Tc während dieser Zeit.
13. Es ist unwahrscheinlich, dass sich Mäuse erholen, wenn ihre Kerntemperatur während der Erholungsphase die Richtung ändert und schließlich 40 ° C überschreitet. Beenden Sie zu diesem Zeitpunkt das Experiment und bewerten Sie die Maus auf humane Standardendpunkte.

Ergebnisse

Die typischen thermoregulatorischen Profile während der Gesamtheit des EHS-Protokolls und der frühen Wiederherstellung einer Maus sind in Abbildung 1Adargestellt. Dieses Profil umfasst vier verschiedene Phasen, die als Kammererwärmungsstufe, inkrementelle Übungsstufe, Steady-State-Übungsstufe und Erholungsphase entweder durch eine schnelle Abkühlung (R) oder eine schwere (S) Methode¹⁷definiert werden können. Zu den wichtigsten thermoregulatorischen Ergebnissen ...

Diskussion

Diese technische Überprüfung zielt darauf ab, Richtlinien für die Leistung eines präklinischen Modells von EHS bei Mäusen bereitzustellen. Detaillierte Schritte und Materialien, die für die Ausführung einer reproduzierbaren EHS-Episode mit unterschiedlichem Schweregrad erforderlich sind, werden bereitgestellt. Wichtig ist, dass das Modell weitgehend die Anzeichen, Symptome und Multiorganfunktionsstörungen nachahmt, die bei menschlichen EHS-Opfern beobachtet^{wurden 11,}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.