Un modèle préclinique de coup de chaleur à l’effort chez la souris

Résumé

Le protocole décrit le développement d’un modèle préclinique standardisé, reproductible et de coup de chaleur à l’effort (EHS) chez la souris exempt de stimuli externes indésirables tels que le choc électrique. Le modèle fournit une plate-forme pour les études mécanistes, préventives et thérapeutiques.

Résumé

Le coup de chaleur est la manifestation la plus grave des maladies liées à la chaleur. Le coup de chaleur classique (SHC), également connu sous le nom de coup de chaleur passif, se produit au repos, tandis que le coup de chaleur à l’effort (EHS) se produit pendant l’activité physique. L’EHS diffère du CHS par l’étiologie, la présentation clinique et les séquelles du dysfonctionnement multiviscéral. Jusqu’à récemment, seuls les modèles de SHC étaient bien établis. Ce protocole vise à fournir des lignes directrices pour un modèle murin préclinique affiné de l’EHS qui est exempt de facteurs limitatifs majeurs tels que l’utilisation d’anesthésie, de contention, de sondes rectales ou de chocs électriques. Des souris C57Bl/6 mâles et femelles, instrumentées avec des sondes télémétriques à température centrale (Tc), ont été utilisées dans ce modèle. Pour se familiariser avec le mode de course, les souris suivent 3 semaines d’entraînement en utilisant des roues de course volontaires et forcées. Par la suite, les souris courent sur une roue forcée à l’intérieur d’une chambre climatique réglée à 37,5 ° C et 40% à 50% d’humidité relative (HR) jusqu’à ce qu’elles présentent une limitation des symptômes (par exemple, perte de conscience) à Tc de 42,1 à 42,5 ° C, bien que des résultats appropriés puissent être obtenus à des températures de chambre comprises entre 34,5 et 39,5 ° C et une humidité comprise entre 30% et 90%. Selon la gravité souhaitée, les souris sont immédiatement retirées de la chambre pour récupérer à température ambiante ou restent dans la chambre chauffée pendant une plus longue durée, ce qui entraîne une exposition plus grave et une incidence plus élevée de mortalité. Les résultats sont comparés à des contrôles d’exercice simulés appariés (EXC) et/ou à des contrôles naïfs (NC). Le modèle reflète bon nombre des résultats physiopathologiques observés dans l’EHS humain, y compris la perte de conscience, l’hyperthermie sévère, les dommages multi-organes ainsi que la libération de cytokines inflammatoires et les réponses de phase aiguë du système immunitaire. Ce modèle est idéal pour la recherche basée sur des hypothèses afin de tester des stratégies préventives et thérapeutiques qui peuvent retarder l’apparition de l’EHS ou réduire les dommages multi-organes qui caractérisent cette manifestation.

Introduction

Le coup de chaleur est caractérisé par un dysfonctionnement du système nerveux central et des lésions organiques ultérieures chez les sujets hyperthermiques¹. Il y a deux manifestations de coup de chaleur. Le coup de chaleur classique (SHC) touche principalement les populations âgées pendant les vagues de chaleur ou les enfants laissés dans des véhicules exposés au soleil pendant les chaudes journées d’été¹. Le coup de chaleur à l’effort (EHS) se produit lorsqu’il y a une incapacité à thermoréguler adéquatement pendant l’effort physique, généralement, mais pas toujours, sous des températures ambiantes élevées entraînant des symptômes neurologiques, une hyperthermie et un dysfonctionnement et des dommages multiviscébraux^{ultérieurs 2}. EHS se produit chez les athlètes récréatifs et d’élite ainsi que le personnel militaire et chez les ouvriers avec et sans déshydratation concomitante^3,4. En effet, l’EHS est la troisième cause de mortalité chez les athlètes lors de l’activité physique^5. Il est extrêmement difficile d’étudier l’EHS chez l’homme car l’épisode peut être mortel ou entraîner des résultats négatifs à long terme pour la santé^6,7. Par conséquent, un modèle préclinique fiable de l’EHS pourrait servir d’outil précieux pour surmonter les limites des observations cliniques rétrospectives et associatives chez les victimes humaines de l’EHS. Les modèles précliniques du SHC chez les rongeurs et les porcs ont été bien caractérisés^8,9,10. Cependant, les modèles précliniques du SHC ne se traduisent pas directement en physiopathologie EHS en raison des effets uniques de l’exercice physique sur le profil thermorégulateur et la réponse immunitaire innée¹¹. En outre, les tentatives précédentes de développer des modèles EHS précliniques chez les rongeurs ont posé des restrictions significatives, y compris des stimuli de stress superposés induits par un choc électrique, l’insertion d’une sonde rectale et des températures corporelles maximales prédéfinies avec des taux de mortalité élevés^12,13^,14,15,16 qui ne correspondent pas aux données épidémiologiques actuelles. Ceux-ci représentent des limites importantes qui peuvent confondre l’interprétation des données et fournir des indices de biomarqueurs peu fiables. Par conséquent, le protocole vise à caractériser et à décrire les étapes d’un modèle préclinique normalisé, hautement reproductible et traduisible de l’EHS chez la souris qui est largement exempt des limitations mentionnées ci-dessus. Les ajustements au modèle qui peuvent entraîner des résultats physiologiques gradués d’un coup de chaleur modéré à mortel sont décrits. À la connaissance des auteurs, il s’agit du seul modèle préclinique de l’EHS présentant de telles caractéristiques, ce qui permet de poursuivre des recherches EHS pertinentes d’une manière basée sur des hypothèses^11,17,18.

Protocole

Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par l’IACUC de l’Université de Floride. Des souris mâles ou femelles C57BL/6J, âgées d’environ 4 mois, pesant entre 27 et 34 g et 20 à 25 g, respectivement, sont utilisées pour l’étude.

1. Implantation chirurgicale du système de surveillance télémétrique de la température

1. À l’arrivée du vendeur, laissez les animaux se reposer dans le vivarium pendant au moins 1 semaine avant la chirurgie afin de minimiser le stress du transport.
2. Le groupe héberge les souris (maximum de 5 par cage selon les directives locales de l’IACUC) jusqu’au jour de la chirurgie pour l’implantation d’un dispositif télémétrique à température. Rangez-les dans des cages standard de 7,25 » (L) x 11,75 » (L) x 5 » (H) contenant de la litière en épi de maïs. Maintenez le cycle de lumière sur un cycle de lumière de 12 x 12 (allumé: 7 AM; éteint: 7 PM). Maintenir la température du boîtier à 20-22 °C et l’humidité relative (HR) à 30%-60%. Fournissez le régime chow standard et l’eau ad libitum jusqu’au protocole EHS.
   REMARQUE: La raison d’être du logement individuel est d’éviter les blessures fréquentes de combat chez les souris mâles C57bl / 6J et de fournir de nombreuses possibilités de course spontanée de la roue pour chaque souris.
3. Pour le placement des dispositifs de télémétrie, anesthésiez la souris avec de l’isoflurane (4%, 0,4-0,6 L / min de flux O₂₎ dans une chambre à induction. Ensuite, placez la souris sous anesthésie continue via un cône de nez (1,5%, 0,6 L / min).
4. Utilisez un lubrifiant pour les yeux, comme une pommade vétérinaire, pour protéger les yeux de l’animal contre les dommages ou les blessures pendant la chirurgie.
5. Pour préparer le site chirurgical, rasez le bas-ventre avec de petites tondeuses à poils d’animaux ou utilisez un dissolvant disponible dans le commerce. Administrer la première dose de buprénorphine sous-cutanée (0,1 mg/kg) pendant cette période.
6. Frottez la zone avec trois lavages de povidone-iode (ou un gommage germicide similaire) suivi d’un rinçage à l’alcool isopropylique à 70% (ou d’une solution saline stérile selon les exigences vétérinaires locales). Ensuite, transférez la souris dans la zone chirurgicale.
7. Utilisez un rideau adhésif pour isoler le site chirurgical sur la souris. À l’aide d’instruments stériles et d’une technique aseptique, faites une incision d’environ 1 cm sur la ligne médiane le long de la linea alba, à environ 0,5 cm de la marge costale. Ensuite, séparez la peau de la couche musculaire et faites une incision légèrement plus petite sur la linea alba, en prenant soin de ne pas endommager les intestins ou les organes internes.
8. Une fois la couche musculaire ouverte, placez le télémètre stérile (dispositif de radiotélémétrie miniature réutilisable sans pile; 16,5 x 6,5 mm) dans la cavité intrapéritonéale devant les artères caudales et les veines et dorsale aux organes digestifs pour lui permettre de flotter librement.
   REMARQUE: Tous les télémètres sont nettoyés à l’eau et au savon, soigneusement rincés et stérilisés au gaz avec de l’oxyde d’éthylène entre les utilisations. Si la stérilisation au gaz n’est pas disponible, l’immersion dans des solutions de stérilisation (conformément à la recommandation du fabricant pour la dilution et le temps d’immersion) est acceptée pour désinfecter et stériliser les télémètres.
9. Fermez l’ouverture abdominale avec une suture stérile résorbable 5-0 et fermez la peau à l’aide d’un simple point de suture interrompu avec une suture 5-0 proline.
   REMARQUE: Permettre au télémètre de flotter dans le compartiment abdominal sans l’attacher à la paroi abdominale (une méthode recommandée par le fabricant) s’est avéré efficace et préféré par les auteurs pour éliminer l’excès de tension dans la paroi abdominale pendant la guérison. De plus, cela n’a aucun impact sur la capacité du récepteur à obtenir le signal de l’émetteur.
10. Placez la souris dans sa cage propre avec un coussin chauffant portable sous la cage. Surveillez la souris toutes les 15 minutes pendant la première heure de récupération de l’anesthésie, puis retournez à l’installation de logement pour animaux.
11. Fournir aux souris des injections sous-cutanées de buprénorphine toutes les 12 h pendant 48 h pendant la récupération et continuer à surveiller les signes de détresse. Si disponible, administrer la buprénorphine à libération lente par voie sous-cutanée toutes les 24 h (1 mg/kg) pendant 48 h. Laissez les souris récupérer pendant environ 2 semaines après la chirurgie avant d’introduire une course volontaire de la roue.

2. Familiarisation : Course volontaire et forcée sur roues

1. Après la récupération de la chirurgie, placez les roues de roulement volontaires dans la cage pour un accès libre à la roue. D’autres sélections de roues de roulement peuvent être tout aussi efficaces, mais assurez-vous qu’elles s’adaptent aux tailles de cage limitées disponibles.
   REMARQUE: Les roues de roulement ont dû être légèrement réduites en dimension pour tenir dans une cage standard.
2. Acclimatez la souris à la roue volontaire dans la cage pendant 2 semaines. Une fois acclimatée, la souris est prête pour l’entraînement avec des procédures de familiarisation pour les roues de course forcées.
3. Effectuez les quatre séances d’entraînement (une/jour) dans la chambre environnementale à température ambiante (~25 °C, 30 % d’humidité relative).
   REMARQUE: Bien que cela soit idéal, les souris ont également été entraînées avec succès à des roues de course forcées identiques à l’extérieur de la chambre. Plusieurs souris peuvent alors être entraînées simultanément sans interférer avec l’utilisation de la chambre.
4. Pour commencer la première séance d’entraînement, laissez la souris libre dans la roue de roulement modifiée pendant 15 minutes en retirant ou en desserrant la courroie d’entraînement du moteur pour permettre à la souris de déterminer la vitesse de la roue et de s’y acclimater de manière non stressante.
   REMARQUE: Les protocoles peuvent être exécutés avec des logiciels et du matériel fournis par le fabricant de la roue de roulement ou peuvent être remplacés par une alimentation programmable externe câblée directement au moteur de la roue, ce qui permet d’automatiser le protocole d’exercice incrémentiel.
5. Calibrez le système pour chaque roue de roulement afin de déterminer la relation entre la tension d’alimentation et les mètres/minute (m/min) de chaque roue.
   REMARQUE: Les roues de roulement forcées ont également été modifiées pour élever le moteur de 15 cm, inverser et déplacer la poulie entraînant la roue à 5 cm au-dessus de la plate-forme du récepteur de télémétrie. Cela a permis à la plate-forme réceptrice d’obtenir des données de télémétrie précises pendant le protocole de fonctionnement sans interférence du moteur.
6. Après une brève période de repos (<5 min), lancez le protocole de roue de roulement forcée. Démarrez la roue à 2,5 m/min et augmentez de 0,3 m/min toutes les 10 minutes pendant un total de 1 h pour imiter la première heure de l’essai EHS réel, mais à température ambiante. Remettez la souris dans sa cage d’origine et laissez une récupération de 24 heures. Effectuez les trois séances de course forcée suivantes de la même manière pendant des jours consécutifs. Après le jour 1, la partie d’acclimatation en roue libre n’est pas nécessaire.
7. Laissez la souris 2-3 jours de lavage ou de récupération du stress de la pratique de la roue de course forcée, mais laissez la souris accéder librement à la roue volontaire de la cage de la maison. La souris est maintenant prête à subir le protocole EHS.

3. Protocole EHS

1. La veille du protocole EHS, placez la souris dans la chambre environnementale à température ambiante (~25 °C, ≈30 % d’humidité relative) pour s’acclimater à la chambre.
2. Utilisez un système d’acquisition de données pour collecter des Tc continus, en moyenne sur des intervalles de 30 s pendant la nuit.
3. Le matin du protocole EHS, assurez-vous que la souris est égale ou inférieure à une plage normale de température diurne avant d’augmenter la température de la chambre (c.-à-d. 36-37,5 °C). Cela garantit que la souris n’a pas de fièvre et n’a pas subi de stress excessif pendant cette période.
4. Une fois que la souris est stable et dans une plage de température centrale normale au repos, retirez la nourriture et l’eau et pesez l’animal. Fermez la porte de la chambre et augmentez la température de la chambre à un objectif de 37,5 °C et de 40 % à 50 % d’humidité relative, ou la température et l’humidité ambiantes^{souhaitées 19}. Vérifiez la température et l’humidité de la chambre à l’aide d’un moniteur de température et d’humidité étalonné.
5. Entourez la chambre d’un rideau occultant pour minimiser la lumière et les perturbations pendant le protocole. Surveillez la souris en continu pendant le protocole via des caméras éclairées IR à distance. Focalisez une deuxième caméra sur le moniteur de température et d’humidité, placé près de la roue de roulement. Effectuez des ajustements au contrôleur pour le point de consigne de la chambre environnementale afin d’assurer des lectures de température précises près de l’animal.
6. Une fois que la chambre a atteint sa température cible telle que mesurée par la deuxième caméra sur le moniteur de température (cela peut prendre environ 30 minutes), ouvrez rapidement la porte de la chambre et placez la souris dans la roue de roulement forcée.
7. Lancez le protocole de roue de course forcée à une vitesse de 2,5 m/min et augmentez la vitesse de 0,3 m/min toutes les 10 minutes jusqu’à ce que la souris atteigne un Tc de 41 °C. Une fois que la souris a atteint cette température centrale, laissez la vitesse rester constante jusqu’à la limitation des symptômes, caractérisée par une perte de conscience apparente, une chute ou un évanouissement en arrière et l’incapacité de continuer à courir ou à s’accrocher au volant. Confirmez ce moment où la souris a trois rotations vers l’arrière sur la roue sans signe de réponse physique. Vous pouvez également identifier un point d’évaluation humain en suivant les règles locales de l’IACUC pour déterminer quand arrêter le protocole (par exemple, lorsque Tc ~ 43 °C). Ce critère d’évaluation est légèrement supérieur à la limitation des symptômes chez pratiquement toutes les souris.
8. Pour exécuter le protocole de refroidissement rapide (R), une fois que la souris atteint la limitation des symptômes, arrêtez la roue et retirez-la immédiatement de la roue de course forcée. Pesez la souris et replacez-la dans sa cage d’origine pour la récupérer à température ambiante. Pendant ce temps, laissez la porte de la chambre ouverte et ramenez le point de consigne de l’incubateur à la température ambiante pour permettre à la chambre de refroidir rapidement. Cette procédure entraîne une survie à long terme de >99%.
9. Pour effectuer une exposition EHS plus sévère (S), gardez la cage domestique de l’animal dans la chambre à 37,5 °C pendant le protocole EHS. Lorsque l’animal atteint la limitation des symptômes, laissez-le rester dans la roue de roulement jusqu’à ce qu’il revienne à la conscience comme observé par la caméra à distance (~ 5-9 min).
10. Ensuite, retirez rapidement la souris de la roue de roulement et retournez-la directement dans sa cage préchauffée pour obtenir un profil de refroidissement beaucoup plus lent(Figure 1A,ligne pointillée rouge), éliminant essentiellement la phase hypothermique EHS. Retirez le dessus du filtre de la cage pendant ce temps pour améliorer l’équilibre avec la chambre.
11. Utilisez une cage de récupération prérefroidie à température ambiante pour effectuer une procédure alternative moins sévère afin d’entraîner une phase hypothermique supprimée mais avec un taux de survie de 100%²⁰.
12. Pour le protocole S, surveillez attentivement la souris pendant la récupération et vérifiez en permanence les points de terminaison humains. Bien qu’il soit difficile de tester à distance les paramètres humains couramment utilisés (par exemple, le réflexe de redressement), observez les souris à distance pour détecter les mouvements normaux pendant la récupération tels que le toilettage, la respiration normale, le léchage, etc. Surveillez le Tc pendant ce temps.
13. Il est peu probable que les souris se rétablissent si leur température centrale s’inverse pendant la phase de récupération, dépassant finalement 40 °C; à ce stade, terminez l’expérience et évaluez la souris pour les points de terminaison humains standard.

Résultats

Les profils thermorégulateurs typiques pendant l’ensemble du protocole EHS et la récupération précoce d’une souris sont illustrés à la figure 1A. Ce profil comprend quatre phases distinctes qui peuvent être définies comme l’étape de chauffage de la chambre, l’étape d’exercice incrémental, l’étape d’exercice à l’état d’équilibre et une étape de récupération par une méthode de refroidissement rapide (R) ou sévère (S)^17. Les princip...

Discussion

Cette revue technique vise à fournir des lignes directrices pour la performance d’un modèle préclinique d’EHS chez la souris. Les étapes détaillées et le matériel requis pour l’exécution d’un épisode EHS reproductible de gravité variable sont fournis. Il est important de noter que le modèle imite en grande partie les signes, les symptômes et le dysfonctionnement multiviscéral observés chez les victimes humaines de^l’EHS11,¹⁹. En outre, ce m...

matériels

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