Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

Resumen

El kit de herramientas genómicas funcionales para los nematodos parásitos Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti incluye transgénesis, mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9 y ARNi. Este protocolo demostrará cómo utilizar la microinyección intragonadal para introducir transgenes y componentes CRISPR en S. stercoralis y S. ratti.

Resumen

El género Strongyloides consiste en múltiples especies de nematodos penetrantes en la piel con diferentes rangos de huéspedes, incluyendo Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti. S. stercoralis es un nematodo parásito de la piel que penetra en la piel y que infecta a aproximadamente 610 millones de personas, mientras que el parásito de la rata S. ratti está estrechamente relacionado con S. stercoralis y se usa a menudo como modelo de laboratorio para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis como S. ratti son fácilmente susceptibles a la generación de transgénicos y knockouts a través de la técnica de administración de ácido nucleico exógeno de microinyección intragonadal, y como tales, han surgido como sistemas modelo para otros helmintos parásitos que aún no son susceptibles a esta técnica.

Los adultos parásitos de Strongyloides habitan en el intestino delgado de su huésped y liberan progenie en el medio ambiente a través de las heces. Una vez en el medio ambiente, las larvas se convierten en adultos de vida libre, que viven en heces y producen progenie que debe encontrar e invadir un nuevo huésped. Esta generación ambiental es exclusiva de la especie Strongyloides y lo suficientemente similar en morfología al nematodo modelo de vida libre Caenorhabditis elegans que las técnicas desarrolladas para C. elegans se pueden adaptar para su uso con estos nematodos parásitos, incluida la microinyección intragonadal. Usando microinyección intragonadal, se puede introducir una amplia variedad de transgenes en Strongyloides. Los componentes CRISPR/Cas9 también pueden ser microinyectados para crear larvas mutantes de Strongyloides . Aquí, se describe la técnica de microinyección intragonadal en Strongyloides, incluida la preparación de adultos de vida libre, el procedimiento de inyección y la selección de la progenie transgénica. Se incluyen imágenes de larvas transgénicas de Strongyloides creadas mediante mutagénesis CRISPR/Cas9. El objetivo de este artículo es permitir a otros investigadores utilizar la microinyección para crear Strongyloides transgénicos y mutantes.

Introducción

Strongyloides stercoralis se ha pasado por alto durante mucho tiempo como un patógeno humano importante en comparación con los anquilostomas más ampliamente reconocidos y el gusano redondo Ascaris lumbricoides¹. Los estudios previos sobre la carga de gusanos a menudo subestimaron gravemente la prevalencia de S. stercoralis debido a la baja sensibilidad de los métodos de diagnóstico comunes para S. stercoralis². En los últimos años, estudios epidemiológicos basados en herramientas diagnósticas mejoradas han estimado que la verdadera prevalencia de infecciones por S. stercoralis es mucho mayor que la reportada anteriormente, aproximadamente 610 millones de personas en todo el mundo².

Tanto S. stercoralis como otras especies de Strongyloides, incluido el parásito de rata estrechamente relacionado y el modelo de laboratorio común S. ratti, tienen un ciclo de vida inusual que es ventajoso para los estudios genómicos experimentales porque consiste en generaciones parásitas y de vida libre (ambientales)³ (Figura 1). Específicamente, tanto S. stercoralis como S. ratti pueden pasar por una sola generación de vida libre. La generación de vida libre consiste en larvas post-parásitas que se convierten en machos y hembras adultos de vida libre; toda la progenie de los adultos de vida libre se convierte en larvas infecciosas, que deben infectar a un huésped para continuar el ciclo de vida. Además, esta generación ambiental o de vida libre puede ser manipulada experimentalmente en el laboratorio. Debido a que los adultos de Strongyloides de vida libre y los adultos de C. elegans comparten una morfología similar, las técnicas como la microinyección intragonadal que se desarrollaron originalmente para C. elegans se pueden adaptar para su uso con Strongyloides adultos de vida libre ^4,5. Mientras que el ADN generalmente se introduce en hembras adultas de vida libre, tanto los machos como las hembras de Strongyloides pueden ser microinyectados⁶. Por lo tanto, las herramientas genómicas funcionales están disponibles para interrogar muchos aspectos de la biología de Strongyloides. Otros nematodos parásitos carecen de una generación de vida libre y, como resultado, no son tan fácilmente susceptibles a las técnicas genómicas funcionales³.

Figura 1: El ciclo de vida de Strongyloides stercoralis. Las hembras parásitas de S. stercoralis habitan el intestino delgado de sus huéspedes mamíferos (humanos, primates no humanos, perros). Las hembras parásitas se reproducen por partenogénesis y ponen huevos dentro del intestino delgado. Los huevos eclosionan mientras aún están dentro del huésped en larvas post-parásitas, que luego se pasan al medio ambiente con heces. Si las larvas postparasitarias son machos, se convierten en machos adultos de vida libre. Si las larvas postparasitarias son hembras, pueden convertirse en hembras adultas de vida libre (desarrollo indirecto) o larvas infecciosas de tercera etapa (iL3s; desarrollo directo). Los machos y hembras de vida libre se reproducen sexualmente para crear progenie que se ve limitada a convertirse en iL3s. Bajo ciertas condiciones, S. stercoralis también puede someterse a una autoinfección, en la que algunas de las larvas postparasitarias permanecen dentro del intestino del huésped en lugar de pasar al medio ambiente en las heces. Estas larvas pueden convertirse en larvas autoinfectivas (L3a) dentro del huésped, penetrar a través de la pared intestinal, migrar a través del cuerpo y, finalmente, regresar al intestino para convertirse en adultos reproductivos. El ciclo de vida de S. ratti es similar, excepto que S. ratti infecta a las ratas y no tiene un ciclo autoinfectivo. La generación ambiental es clave para el uso de especies de Strongyloides para estudios genéticos. Las hembras adultas de vida libre (P₀) pueden ser microinyectadas; su progenie, que se convertirá en iL3, son los potenciales transgénicos F₁. Esta figura ha sido modificada a partir de Castelletto et al. ³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

S. stercoralis comparte muchos aspectos de su biología con otros nematodos parásitos humanos gastrointestinales, incluida la invasión del huésped y la modulación inmune del huésped. Por ejemplo, los anquilostomas parásitos humanos en los géneros Necator y Ancylostoma también infectan por penetración en la piel, navegan de manera similar a través del cuerpo y, en última instancia, residen como adultos parásitos en el intestino delgado⁷. Por lo tanto, muchos nematodos gastrointestinales probablemente usan comportamientos sensoriales comunes y técnicas de evasión inmune. Como resultado, el conocimiento obtenido de Strongyloides complementará los hallazgos en otros nematodos menos tratables genéticamente y conducirá a una comprensión más completa de estos parásitos complejos e importantes.

Este protocolo de microinyección describe el método para introducir ADN en hembras adultas de vida libre de Strongyloides para producir progenie transgénica y mutante. Se describen los requisitos de mantenimiento de la cepa, incluido el momento de desarrollo de los gusanos adultos para microinyecciones y la recolección de progenie transgénica. Se incluyen protocolos y una demostración de la técnica completa de microinyección, junto con protocolos para el cultivo y detección de progenie transgénica, junto con una lista de todos los equipos y consumibles necesarios.

Protocolo

NOTA: Los jerbos se usaban para pasar S. stercoralis, y las ratas se usaban para pasar S. ratti. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Oficina de Supervisión de Investigación Animal de UCLA (Protocolo No. 2011-060-21A), que se adhiere a los estándares AAALAC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las siguientes tareas deben completarse al menos un día antes de la microinyección: cultivo de gusanos, preparación de almohadillas de microinyección, creación de construcciones para la mezcla de microinyección y propagación de bacterias (E. coli HB101) en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) de 6 cm⁸. Las hembras de vida libre requieren un mínimo de 24 h de recolección post-fecal a 25 ° C para convertirse en adultos jóvenes antes de que puedan ser microinyectadas. Las almohadillas de microinyección deben estar completamente secas. Las placas bacterianas deben secarse y establecer un césped pequeño.

1. Preparación de portaobjetos de microinyección: al menos un día antes de la inyección

NOTA: Los gusanos se montan en fundas de microinyección con almohadillas de agar secas para inyección.

1. Ajuste un bloque de calor a 90 °C.
2. Agregue 5 ml de ddH₂O, luego 100 mg de agarosa a un tubo de vidrio de borosilicato.
3. Caliente la mezcla de agarosa en el tubo sobre una llama hasta que la agarosa se disuelva.
4. Coloque el tubo en un bloque de calor a 90 °C para mantener la agarosa en estado líquido.
5. Deje caer ~ 180 μL de la solución de agarosa en un trozo de cubierta usando una pipeta Pasteur de vidrio o una pipeta con una punta de plástico. Inmediatamente deje caer una segunda funda en la parte superior para aplanar la agarosa en una almohadilla delgada.
6. Después de 5-10 s, retire la cubierta superior deslizando los dos separados. Determine en qué diapositiva está la almohadilla de agar y colóquela boca arriba.
7. Seleccione un pequeño trozo de fragmento de vidrio de un trozo de cubierta roto y presiónelo suavemente en el agar cerca del borde superior de la almohadilla con fórceps (Figura suplementaria S1).
8. Continúe haciendo almohadillas de microinyección con la solución de agarosa.
9. Seque las almohadillas de agarosa durante la noche en el banco o en un horno. Conservar en la caja de la funda.
   NOTA: Las almohadillas de agarosa se pueden usar hasta por 2 meses, pero solo se usan para una inyección.

2. Cultivo de Strongyloides para obtener gusanos para microinyección: 1 - 2 días antes de la inyección

NOTA: Se puede encontrar un protocolo de mantenimiento de cepas en el Material Suplementario, que incluye una descripción detallada de cómo infectar jerbos y ratas con nematodos y cosechar nematodos de las heces de animales infectados.

1. Dos días antes del día de la inyección, coloque a los animales^{infectados 9,10} en jaulas de recolección durante la noche.
2. A la mañana siguiente, recoja las heces infestadas y haga placas de carbón fecal ^9,10.
3. Coloque un plato a 25 ° C durante 24 h para permitir que los gusanos de vida libre se conviertan en adultos jóvenes.
4. La noche antes del día de la inyección, coloque a los animales huéspedes no infectados en jaulas de recolección.
5. El día de la inyección, recoja las heces no infestadas para el cultivo posterior a la inyección.

3. Hacer la mezcla de microinyección: antes o el día de la inyección

NOTA: La mezcla de microinyección consiste en los plásmidos de interés diluidos a la concentración deseada en solución salina tamponada por gusano (BU) (50 mM Na₂HPO₄, 22 mM KH₂PO₄, 70 mM NaCl)¹¹.

1. Determinar la concentración de las cepas de plásmidos y la concentración deseada en la mezcla de microinyección (Tabla 1).

Mezcla de microinyección: construcción del reportero
Componente	Concentración de existencias	Importe	Concentración final
pMLC30 gpa-3::gfp	300 ng/μL	1,7 μL	50 ng/μL
Bu	Na	8,3 μL	Na
total		10 μL	50 ng/μL
Mezcla de microinyección: mutagénesis CRISPR/Cas9
Componente	Concentración de existencias	Importe	Concentración final
pMLC47 tax-4 sgRNA	300 ng/μL	2,7 μL	80 ng/μL
pEY11 Plásmido Ss-tax-4 HDR	400 ng/μL	2,0 μL	80 ng/μL
Plásmido pPV540 strCas9	350 ng/μL	1,1 μL	40 ng/μL
Bu	Na	4,2 μL	Na
total		10 μL	200 ng/μL
Mezcla de microinyección: integración de piggyBac
Componente	Concentración de existencias	Importe	Concentración final
pMLC30 gpa3::gfp	300 ng/μL	2,0 μL	60 ng/μL
Plásmido de transposasa pPV402	450 ng/μL	0,9 μL	40 ng/μL
Bu	Na	7,1 μL	Na
total		10 μL	100 ng/μL

Tabla 1: Ejemplos de mezclas de microinyección. Los plásmidos y las concentraciones para tres mezclas de microinyección de ejemplo: una para un gpa-3::GFP reporter construct¹⁰, una para la interrupción mediada por CRISPR/Cas9 del locus Ss-tax-4 ^14,15, y otra para la integración mediada por piggyBac de una construcción Ss-gpa-3::GFP construct 13,17,18. strCas9 denota el gen Cas9 optimizado para codones Strongyloides. Las concentraciones finales enumeradas se utilizan comúnmente en mezclas de microinyección de Strongyloides.

2. Diluya los plásmidos en BU a un volumen total de 10-20 μL.
3. Gire la mezcla a través de una columna de filtro a 5.000 × g durante 1-2 min.
4. Utilice la mezcla de microinyección inmediatamente o guárdela a -20 °C para su uso futuro.

4. Recolecte Strongyloides adulto joven para microinyección: mañana del día de la inyección

1. Configure el aparato de Baermann con 1 placa fecal-carbón de Strongyloides adulto joven (Figura 2).
   NOTA: La placa fecal-carbón vegetal puede contener algunas larvas infecciosas. El equipo de protección personal consiste en una bata de laboratorio, guantes y protección ocular. No se debe exponer ninguna piel entre el guante y la manga de la bata de laboratorio.

Figura 2: El aparato de Baermann utilizado para recolectar gusanos parásitos de cultivos¹⁰. El contenido de una placa de carbón fecal se coloca en la parte superior de una columna de agua tibia. Los gusanos migran al agua y se acumulan en la parte inferior del embudo. (A) Para configurar el aparato de Baermann, el soporte para el embudo de Baermann se sujeta al banco con una abrazadera en C. Un tubo de goma unido al extremo del embudo se cierra con abrazaderas de pellizco, y se coloca un cubo de captura debajo del tubo para goteos. Se agrega agua tibia al embudo de vidrio. (B) El soporte de anillo de plástico para la mezcla fecal-carbón vegetal se recubre con 3 piezas de tejidos de laboratorio (izquierda). Se utiliza un palo de madera o un depresor de lengua (centro) para transferir el contenido de una placa de carbón fecal (derecha) al soporte del anillo de plástico. (C) Un primer plano de la parte inferior del soporte del anillo de plástico para la mezcla fecal-carbón, que muestre la doble capa de tul de nylon que recubre la parte inferior del soporte. (D) El soporte de carbón fecal se coloca en la parte superior del embudo de vidrio. (E) El tejido de laboratorio se humedece con agua y se cierra sobre la mezcla fecal-carbón. Se agrega más agua tibia para sumergir principalmente el carbón fecal. (F) La configuración completa de Baermann, con el cultivo fecal-carbón sumergido bajo agua tibia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Instale un embudo de vidrio con tubos de recolección de goma en un soporte de anillo con una junta tórica y asegúrelo con una abrazadera. Cierre el tubo de recogida con 2 abrazaderas de pellizco (Figura 2A).
3. Coloque un cubo de captura debajo del embudo para atrapar goteos.
4. Agregue agua tibia (aproximadamente 40 °C) al embudo a 5 cm por debajo del borde. Verifique que el sistema no tenga fugas.
5. Forre el soporte Baermann, un tamiz hecho de 2 anillos de plástico con 2 capas de redes de tul de nylon aseguradas entre ellas, con 3 piezas superpuestas de tejido de laboratorio. Agregue la mezcla fecal-carbón vegetal al soporte de Baermann (Figura 2B, C).
6. Coloque el soporte baermann con la mezcla fecal-carbón en el embudo. Doble los tejidos alrededor de la mezcla fecal-carbón y agregue suficiente agua para sumergir la mayor parte del carbón fecal. No llene por encima de 2 cm del borde del embudo (Figura 2D, E).
7. Cubra el embudo con una tapa de placa de Petri de plástico de 15 cm para contener el olor. Etiquete el embudo según sea necesario (Figura 2F).
8. Espere de 30 minutos a 1 h para recoger los gusanos del aparato de Baermann.
9. Sostenga un tubo de centrífuga de 50 ml debajo del tubo de goma en la parte inferior del embudo. Abra cuidadosamente las abrazaderas en la parte inferior para dispensar 30-40 ml de agua que contiene gusanos en el tubo de 50 ml.
10. Transfiera 15 ml del agua de Baermann que contiene los gusanos a un tubo centrífugo de 15 ml. Gire el tubo centrífugo de 15 ml durante 1 minuto a ~ 750 × g (lento). Alternativamente, permita que los gusanos se asienten por gravedad durante 10-15 minutos.
11. Retire el sobrenadante a ~ 2 ml y deseche el sobrenadante en un recipiente líquido de desecho con yodo para matar cualquier gusano.
12. Agregue más agua baermann al tubo de recolección de 15 ml y repita el giro. Retire el sobrenadante a ~2 ml y deséchelo como en el paso 4.11.
13. Repita los pasos 4.11 y 4.12 hasta que todos los gusanos se recojan en el tubo centrífugo de 15 ml. Después del giro final, retire la mayor cantidad de agua posible.
14. Inspeccione el pellet de gusanos (40-100 μL) en la parte inferior del tubo. Si no hay gusanos visibles, espere otras 1-2 h e intente recolectar más gusanos del aparato de Baermann.
15. Transfiera los gusanos en la menor cantidad de agua posible a una placa NGM de 6 cm al 2% con un césped de E. coli HB101. Utilice esta placa como placa fuente para la microinyección.
16. Deseche la mezcla fecal-carbón tratándola con yodo diluido (una dilución del 50% del yodo de Lugol en agua), envolviéndola en una película plástica para atrapar goteos y colocándola en un recipiente de desechos de riesgo biológico.
17. Agregue 10 ml de yodo diluido al cubo de captura y drene el exceso de agua del Baermann en él.
18. Lave los componentes reutilizables (el embudo, el cubo de captura, el soporte de plástico con tul, la tapa de plástico y las abrazaderas) con lejía al 10% y enjuague bien.

5. Tirar y cargar agujas de microinyección: justo antes de la inyección

1. Prepare agujas de microinyección tirando de tubos capilares de vidrio con un extractor de agujas.
   NOTA: Los ajustes de ejemplo para un extractor de agujas comercial equipado con un filamento de platino/iridio de 3 mm son Heat = 810-820, Pull = 800-820, micrometer = 2.5.
2. Vea las puntas bajo un microscopio de disección. Si las agujas tienen la forma deseada (Figura 3A-F), tire de 4-6 agujas (2-3 tubos capilares). Para lograr la forma adecuada de la aguja, cambie la configuración según sea necesario: ajuste la configuración de calor o tracción en 10 y tire de las agujas nuevas hasta que la forma del cónico y el eje sean más apropiados.

Figura 3: Agujas de microinyección y una hembra adulta de Strongyloides stercoralis con sitios óptimos para la microinyección identificados. (A-F) Imágenes de agujas de microinyección. (A-B) El eje se estrecha (A) y la punta (B) de una aguja que tiene la forma correcta para la microinyección. La punta es lo suficientemente afilada como para perforar la cutícula y lo suficientemente estrecha como para no causar daños excesivos. (C-D) El eje se estrecha (C) y la punta (D) de una aguja de microinyección que tiene una forma incorrecta para la microinyección. La punta es demasiado roma y ancha, y causará un daño excesivo al gusano. (E-F) El eje se estrecha (E) y la punta (F) de una aguja que es probable que sea demasiado larga y delgada para funcionar para la microinyección. La punta en F es muy similar a la punta en D. Sin embargo, el eje es más estrecho y demasiado flexible para perforar efectivamente la cutícula. Además, las agujas muy delgadas se obstruyen fácilmente. (G) Una imagen de todo el gusano correctamente posicionado para la microinyección, asumiendo que la aguja está entrando desde la derecha. Anterior está hacia abajo y hacia la izquierda; la vulva está indicada por la punta de flecha. La gónada es visible a lo largo del lado derecho de la hembra. Esta hembra tiene un solo óvulo en su útero (indicado por el asterisco). (H, I) Vistas ampliadas de los sitios de microinyección. El ángulo de la flecha se aproxima al ángulo de la aguja de inyección. La vulva se puede utilizar como un punto de referencia; está en el lado opuesto del gusano de los brazos de la gónada. Los brazos de la gónada se curvan alrededor del intestino, y los extremos con los núcleos divisorios están opuestos a la vulva. (H) El brazo posterior de la gónada; (I) el brazo anterior. Se puede inyectar uno o ambos brazos. Para H, I, las convenciones son como en G. Barras de escala = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Guarde las agujas tiradas en una placa de Petri de plástico de 15 cm con un trozo de cinta enrollada para asegurar las agujas y evitar la acumulación de polvo en las puntas.
4. Coloque una gota de 0,7 μL de la mezcla de microinyección en el extremo abierto del eje. Cuelgue la aguja perpendicular a un estante con un trozo de cinta enrollada para llenar el eje cónico con la mezcla dentro de los 10 minutos. Prepare 2 agujas a la vez en caso de que la primera no funcione.

6. Preparar el microscopio y romper la aguja

NOTA: La microinyección utiliza un microscopio invertido con objetivos de 5x y 40x equipado con una configuración de microinyector para controlar el movimiento de la aguja. El microscopio invertido debe colocarse sobre una mesa pesada o una mesa de aire antivibración para reducir el ruido vibratorio. El soporte de la aguja del microinyector está conectado al gas nitrógeno que aplica la presión necesaria para administrar la mezcla de microinyección. Se utiliza un microscopio de disección más pequeño cerca para transferir los gusanos.

1. Ajuste la presión del tanque de gas a ~ 40-60 psi para romper la aguja y a ~ 30-50 psi para la microinyección, dependiendo del flujo de líquido.
2. En el microscopio de disección, cubra el fragmento de vidrio en la cubierta de la almohadilla de microinyección con aceite de halocarbono utilizando una selección de gusano de platino estándar.
3. Coloque la cubierta de la almohadilla de microinyección en el endoscopio de microinyección y ubique el fragmento de vidrio cubierto de aceite. Alinee el fragmento de vidrio de tal manera que un borde sea perpendicular a la dirección de la aguja para que sirva como la superficie utilizada para romper la aguja.
4. Verifique que la aguja no tenga burbujas o desechos en el eje cónico con el microscopio de disección. Luego, asegure la aguja 1-1.5 cm en el soporte presurizado.
5. Coloque la punta de la aguja en el centro del campo de visión del microscopio a ojo. Luego, bajo un aumento bajo, coloque la punta de la aguja en el campo de visión, perpendicular al lado del fragmento de vidrio.
6. Cambie a alta potencia y alinee la punta de la aguja con el borde del vidrio, cerca pero sin tocarlo.
   NOTA: Cuando se tiran, las agujas se fusionan y se cierran.
7. Para romper la punta de la aguja y permitir el flujo de líquido, tóquela suavemente en el costado de la pieza de vidrio mientras aplica presión continua del gas (Figura suplementaria S1). Una vez que el líquido comience a fluir, verifique la forma de la punta y asegúrese de que esté afilado con líquido que fluya fácilmente.
   NOTA: Si el líquido fluye demasiado rápido o el extremo es demasiado romo, los gusanos se dañarán durante la microinyección (Video 1 y Figura 3A-F).
8. Cuando el líquido fluya bien de la aguja, mueva el portaobjetos de microinyección al endoscopio de disección y coloque gotas de aceite de halocarbono de 1-2 μL en la almohadilla de agar para la colocación de los gusanos.
9. Transfiera 20-30 Strongyloides adultos jóvenes a una placa NGM al 2% sin bacterias durante al menos 5 minutos para eliminar el exceso de bacterias superficiales y seleccionar gusanos individuales para la microinyección. Agregue más gusanos a la placa NGM según sea necesario mientras inyecta.

7. Microinyecting Strongyloides

1. Use una pequeña cantidad de aceite de halocarbono en una selección de gusanos para seleccionar una hembra adulta joven de Strongyloides con 1-4 huevos en su gónada de la placa NGM al 2% sin bacterias.
2. Transfiera el gusano a una pequeña gota de aceite en la almohadilla de agar. Usando el pico de gusano, coloque suavemente el gusano para que no esté enrollado y la gónada sea visible y de fácil acceso. Observe la dirección de la gónada (Figura 3G).
3. Coloque el gusano en el campo de visión del microscopio de microinyección. Asegúrese de que la gónada esté en el mismo lado que la aguja y colocada de modo que la aguja entre en contacto con la gónada en un ligero ángulo (Figura 3H, I).
4. Lleve la punta de la aguja al lado del gusano en el mismo plano focal. Apunta al brazo de la gónada cerca de la mitad del gusano. Use el microinyector para insertar la aguja suavemente en la gónada (Video 2).
5. Aplique inmediatamente presión a la aguja para llenar suavemente todo el brazo de la gónada con la solución de ADN. Determinar a ojo cuándo se ha inyectado suficiente líquido (Video 2).
   NOTA: Puede tomar hasta 2 s para llenar la gónada.
6. Retire la aguja y verifique que la herida se cierre.
   NOTA: El gusano está demasiado dañado para producir progenie si la gónada sobresale a través de la pared del cuerpo (Video suplementario S1).
7. Repetir con el otro brazo de la gónada si es visible.
8. Cuando termine de inyectar, verifique rápidamente que la aguja no esté obstruida aplicando presión con la punta de la aguja en la almohadilla de agar. Transfiera la diapositiva con el gusano inyectado al microscopio de disección.
9. Para recuperar el gusano inyectado, primero coloque unas gotas de BU en el gusano para flotarlo fuera de la almohadilla de agar.
10. Recolecte una pequeña cantidad de bacterias HB101 en una selección de gusanos. Toque el gusano con las bacterias adherentes en el pico del gusano para eliminarlo del líquido.
11. Transfiera suavemente el gusano a la placa de recuperación , una placa NGM al 2% que contiene un césped HB101.
    NOTA: El gusano debería comenzar a gatear en cuestión de minutos.
12. Después de que se hayan inyectado algunas hembras, agregue algunos machos no inyectados de la placa de origen.
    NOTA: Un mínimo de un macho por cinco hembras es una buena línea de base; se prefiere un exceso de machos.
13. Repita todos los pasos hasta que se hayan inyectado suficientes hembras para el experimento.
14. Deje a los adultos en la placa de recuperación durante al menos 1 h después de la inyección para permitir que los gusanos se recuperen y se apareen.

8. Recuperación y cultivo de Strongyloides inyectados

1. Recolecte heces durante la noche de animales huéspedes no infectados, utilizando el mismo protocolo que para los animales infectados.
2. Mezcle las heces no infestadas con una pequeña cantidad de carbón (proporción de heces a carbón de aproximadamente 2 a 1 para estas placas).
3. Vierta una pequeña cantidad de la mezcla fecal-carbón en una placa de Petri de 6 cm forrada con papel de filtro húmedo. Asegúrese de que la mezcla no toque la tapa del plato.
4. Inunde la placa de recuperación con BU. Usando un juego de pipetas a 3 μL, transfiera los gusanos a las heces en la placa fecal-carbón. Coloque los gusanos directamente sobre las heces, no sobre el carbón.
5. Verifique que los adultos estén en la placa fecal-carbón con un endoscopio de disección.
6. Para cultivar los gusanos, coloque la placa en una cámara humidificada, es decir, una caja de plástico con una tapa ajustada forrada con toallas de papel húmedas.
   NOTA: Después de 2 días, habrá una mezcla de etapas larvales. Después de 5 días, la mayoría de las larvas se habrán convertido en iL3; quedarán algunas larvas más jóvenes. Después de 7 días, todas las larvas deben ser iL3s.

9. Recolección y cribado de larvas F ₁ para recuperar transgénicos/knockouts

1. Usando una configuración de Baermann, recoja las larvas de las placas de cultivo de carbón fecal a pequeña escala posteriores a la inyección. Para obtener tantas larvas como sea posible, espere al menos 2 h antes de recuperar los gusanos del aparato de Baermann.
2. Concentre las larvas en un tubo de centrífuga de 15 ml como en los pasos 4.10-4.14 y transfiera las larvas a un pequeño vaso de reloj con BU.
3. Si las larvas se utilizarán para experimentos de comportamiento, use placas NGM al 2% con un césped grueso de HB101 para la detección.
   1. Transfiera 20-30 larvas al césped HB101.
      NOTA: Las bacterias ralentizarán el movimiento de las larvas.
   2. Bajo un microscopio de disección de fluorescencia, identifique las larvas que expresan el transgén de interés. Use una púa de gusano para seleccionar las larvas transgénicas y muévalas a un pequeño vaso de reloj con BU.
   3. Use una nueva placa HB101 para examinar otro pequeño lote de larvas. Cuando se hayan recolectado suficientes larvas para uso experimental, trate las placas HB101 y el exceso de gusanos con yodo diluido (50% de yodo de Lugol diluido en agua) y deséchelos como desechos de riesgo biológico. Alternativamente, mate el exceso de gusanos usando un limpiador de perrera concentrado que contenga cloruros de alquil bencil amonio.
   4. Use los gusanos inmediatamente o déjelos en un vidrio de reloj poco profundo en una pequeña cantidad de BU durante la noche.
      NOTA: Los gusanos pueden volverse hipóxicos si el líquido es demasiado profundo. Es posible que dejar larvas en BU durante la noche pueda afectar ciertos comportamientos; por lo tanto, use larvas para experimentos de comportamiento dentro de las 6 h.
4. Si las larvas se utilizarán para microscopía y no para ensayos de comportamiento, inmovilice los gusanos mediante parálisis de nicotina de forma reversible para la detección.
   1. Usando una cuchilla de afeitar, puntúe una rejilla en la parte inferior de plástico de una placa de quimiotaxis^{de 10 cm 12} para que sea más fácil realizar un seguimiento de la ubicación de los gusanos en la placa.
   2. Deje caer ~ 3 μL de larvas en BU en un cuadrado en la cuadrícula. Llene tantos cuadrados como sea necesario. No use los que están cerca de los bordes de la placa, ya que las larvas pueden arrastrarse a los lados de la placa.
   3. Agregue gotas de 15-20 μL de nicotina al 1% en agua a las gotas de gusano.
      NOTA: Después de 4 minutos, los gusanos se paralizarán.
   4. Examine los gusanos con un microscopio de disección de fluorescencia.
   5. Use un pico de gusano para transferir las larvas transgénicas a un pequeño vaso de reloj con 1-2 ml de BU.
      NOTA: Las larvas estarán paralizadas durante varias horas y se pueden montar fácilmente en portaobjetos de microscopio para microscopía. Si se dejan durante la noche en BU, los iL3 se recuperarán y pueden usarse para algunos ensayos o infección del huésped mamífero. Sin embargo, la parálisis de la nicotina y la incubación nocturna en BU pueden afectar ciertos comportamientos.

Resultados

Si el experimento tuvo éxito, las larvas de F₁ expresarán el fenotipo transgén y/o mutante de interés (Figura 4). Sin embargo, las tasas de transformación son muy variables y dependen de las construcciones, la salud de los gusanos, las condiciones de cultivo posteriores a la inyección y la habilidad del experimentador. En general, un experimento exitoso producirá larvas de >15 F₁ por hembra inyectada y una tasa de transformación del >3% para los marcadores fluor...

Discusión

Este protocolo de microinyección detalla los métodos para introducir constructos para la transgénesis y la mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 en S. stercoralis y S. ratti. Tanto para S. stercoralis como para S. ratti, la supervivencia posterior a la inyección y la tasa de transgénesis o mutagénesis están sujetas a varias variables que pueden ajustarse.

La primera consideración crítica para una transgénesis exitosa es cómo se construyen los tran...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope