Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

Özet

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Özet

Strongyloides cinsi, Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti dahil olmak üzere farklı konakçı aralıklarına sahip çok sayıda cilde nüfuz eden nematod türünden oluşur. S. stercoralis yaklaşık 610 milyon insanı enfekte eden insan-parazitik, cilde nüfuz eden bir nematoddur, sıçan paraziti S. ratti ise S. stercoralis ile yakından ilişkilidir ve genellikle S. stercoralis için bir laboratuvar modeli olarak kullanılır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti, intragonadal mikroenjeksiyonun eksojen nükleik asit dağıtım tekniği ile transgenik ve nakavt oluşumuna kolayca uygundur ve bu nedenle, henüz bu tekniğe uygun olmayan diğer parazitik helmintler için model sistemler olarak ortaya çıkmıştır.

Paraziter Strongyloides yetişkinleri, konakçılarının ince bağırsağında yaşar ve dışkı yoluyla çevreye soy salgılarlar. Çevreye girdikten sonra, larvalar dışkıda yaşayan ve yeni bir konakçı bulması ve istila etmesi gereken soy üreten serbest yaşayan yetişkinlere dönüşür. Bu çevresel nesil, Strongyloides türlerine özgüdür ve morfolojide, C. elegans için geliştirilen tekniklerin, intragonadal mikroenjeksiyon da dahil olmak üzere bu parazitik nematodlarla kullanım için uyarlanabileceği serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans modeline yeterince benzer. İntragonadal mikroenjeksiyon kullanılarak, Strongyloides'e çok çeşitli transgenler sokulabilir. CRISPR / Cas9 bileşenleri ayrıca mutant Strongyloides larvaları oluşturmak için mikroenjekte edilebilir. Burada, serbest yaşayan yetişkinlerin hazırlanması, enjeksiyon prosedürü ve transgenik döl seçimi de dahil olmak üzere Strongyloides'e intragonadal mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mutagenezi kullanılarak oluşturulan transgenik Strongyloides larvalarının görüntüleri dahil edilmiştir. Bu makalenin amacı, diğer araştırmacıların transgenik ve mutant Strongyloides oluşturmak için mikroenjeksiyon kullanmalarını sağlamaktır.

Giriş

Strongyloides stercoralis uzun zamandır daha yaygın olarak tanınan kancalı kurtlara ve yuvarlak kurt Ascaris lumbricoides^1'e kıyasla önemli bir insan patojeni olarak göz ardı edilmiştir. Solucan yükü ile ilgili önceki çalışmalar, S. stercoralis 2 için yaygın tanı yöntemlerinin düşük duyarlılığı nedeniyle S. stercoralis prevalansını sıklıkla ciddi şekilde hafife ^almıştır. Son yıllarda, gelişmiş tanı araçlarına dayanan epidemiyolojik çalışmalar, S. stercoralis enfeksiyonlarının gerçek prevalansının daha önce bildirilenden çok daha yüksek olduğunu, dünya çapında yaklaşık 610 milyon insanın² olduğunu tahmin etmektedir.

Hem S. stercoralis hem de yakından ilişkili sıçan paraziti ve ortak laboratuvar modeli S. ratti de dahil olmak üzere diğer Strongyloides türleri, deneysel genomik çalışmalar için avantajlı olan alışılmadık bir yaşam döngüsüne sahiptir, çünkü hem parazitik hem de serbest yaşayan (çevresel) nesillerden oluşur³ (Şekil 1). Spesifik olarak, hem S. stercoralis hem de S. ratti, tek bir serbest yaşayan nesil boyunca döngü yapabilir. Serbest yaşayan nesil, serbest yaşayan yetişkin erkek ve dişilere dönüşen parazit sonrası larvalardan oluşur; Serbest yaşayan yetişkinlerin tüm soyları, yaşam döngüsüne devam etmek için bir konağı enfekte etmesi gereken enfektif larvalara dönüşür. Ayrıca, bu çevresel veya serbest yaşayan nesil laboratuvarda deneysel olarak manipüle edilebilir. Serbest yaşayan Strongyloides yetişkinleri ve C. elegans yetişkinleri benzer morfolojiyi paylaştığından, başlangıçta C. elegans için geliştirilen intragonadal mikroenjeksiyon gibi teknikler, serbest yaşayan yetişkin Strongyloides ^4,5 ile kullanım için uyarlanabilir. DNA genellikle serbest yaşayan yetişkin kadınlara sokulmuş olsa da, Strongyloides'in hem erkekleri hem de dişileri mikroenjekte edilebilir⁶. Bu nedenle, Strongyloides'in biyolojisinin birçok yönünü sorgulamak için fonksiyonel genomik araçlar mevcuttur. Diğer paraziter nematodlar serbest yaşayan bir nesilden yoksundur ve sonuç olarak, fonksiyonel genomik tekniklere kolayca uygun değildir³.

Resim 1: Strongyloides stercoralis yaşam döngüsü. S. stercoralis parazitik dişileri, memeli konakçılarının (insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler) ince bağırsağında yaşar. Paraziter dişiler partenogenez ile çoğalır ve ince bağırsakta yumurta bırakır. Yumurtalar hala konakçının içindeyken parazit sonrası larvalara yumurtadan çıkar ve bunlar daha sonra dışkı ile çevreye geçirilir. Post-paraziter larvalar erkekse, serbest yaşayan yetişkin erkeklere dönüşürler. Post-paraziter larvalar dişi ise, serbest yaşayan yetişkin dişilere (dolaylı gelişim) veya üçüncü aşama enfektif larvalara (iL3'ler; doğrudan gelişim) dönüşebilirler. Serbest yaşayan erkekler ve dişiler, iL3'ler haline gelmek için kısıtlanmış soylar oluşturmak için cinsel olarak çoğalırlar. Belirli koşullar altında, S. stercoralis ayrıca parazit sonrası larvaların bir kısmının dışkıda çevreye geçmek yerine konakçı bağırsağın içinde kaldığı otoenfeksiyona da maruz kalabilir. Bu larvalar, konakçının içinde otoenfektif larvalara (L3a) dönüşebilir, bağırsak duvarından nüfuz edebilir, vücuttan göç edebilir ve sonunda üreme yetişkinleri olmak için bağırsağa geri dönebilir. S. ratti'nin yaşam döngüsü benzerdir, ancak S. ratti sıçanları enfekte eder ve otoenfektif bir döngüye sahip değildir. Çevresel üretim, genetik çalışmalar için Strongyloides türlerini kullanmanın anahtarıdır. Serbest yaşayan yetişkin dişiler (P₀) mikroenjekte edilebilir; hepsi iL3'ler haline gelecek olan soyları, potansiyel_F1 transgenikleridir. Bu rakam Castelletto ve ark.'dan değiştirilmiştir. ³. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S. stercoralis biyolojisinin birçok yönünü konakçı istilası ve konakçı immün modülasyonu dahil olmak üzere diğer gastrointestinal insan-paraziter nematodlarla paylaşır. Örneğin, Necator ve Ancylostoma cinslerindeki insan-parazitik kancalı kurtlar da cilt penetrasyonu ile enfekte olur, vücutta benzer şekilde gezinir ve sonuçta ince bağırsakta parazitik yetişkinler olarak bulunur⁷. Bu nedenle, birçok gastrointestinal nematod muhtemelen ortak duyusal davranışları ve immün kaçınma tekniklerini kullanır. Sonuç olarak, Strongyloides'ten toplanan bilgiler, genetik olarak daha az izlenebilir diğer nematodlardaki bulguları tamamlayacak ve bu karmaşık ve önemli parazitlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır.

Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenik ve mutant döl yapmak için DNA'yı Strongyloides serbest yaşayan yetişkin dişilere sokma yöntemini özetlemektedir. Mikroenjeksiyonlar için yetişkin solucanların gelişimsel zamanlaması ve transgenik söllerin toplanması da dahil olmak üzere suş bakım gereksinimleri açıklanmaktadır. Protokoller ve tüm mikroenjeksiyon tekniğinin bir gösterimi, transgenik söllerin kültürlenmesi ve taranması için protokollerle birlikte, gerekli tüm ekipman ve sarf malzemelerinin bir listesi ile birlikte dahil edilmiştir.

Protokol

NOT: Gerbiller S. stercoralis'i geçmek için kullanıldı ve sıçanlar S. ratti'yi geçmek için kullanıldı. Tüm prosedürler, AAALAC standartlarına ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uyan UCLA Hayvan Araştırma Gözetim Ofisi (Protokol No. 2011-060-21A) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki görevler mikroenjeksiyondan en az bir gün önce tamamlanmalıdır: solucan kültürleme, mikroenjeksiyon pedleri hazırlama, mikroenjeksiyon karışımı için yapılar oluşturma ve bakterileri (E. coli HB101) 6 cm Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarına yayma⁸. Serbest yaşayan dişiler, mikroenjekte edilmeden önce genç yetişkinlere dönüşmek için 25 ° C'de en az 24 saat dışkı sonrası toplama gerektirir. Mikroenjeksiyon pedleri tamamen kuru olmalıdır. Bakteriyel plakalar kurumalı ve küçük bir çim oluşturmalıdır.

1. Mikroenjeksiyon slaytlarının hazırlanması: enjekte edilmeden en az bir gün önce

NOT: Solucanlar, enjeksiyon için kuru agar pedli mikroenjeksiyon kapaklarına monte edilir.

1. Bir ısı bloğunu 90 °C'ye ayarlayın.
2. Bir borosilikat cam tüpe 5 mL ddH₂O, daha sonra 100 mg agaroz ekleyin.
3. Agaroz karışımını, agaroz çözülene kadar tüpteki bir alev üzerinde ısıtın.
4. Agarozu sıvı halde tutmak için tüpü 90 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin.
5. Agaroz çözeltisinin ~ 180 μL'sini bir cam Pasteur pipet veya plastik uçlu bir pipet kullanarak bir kapak kapağına bırakın. Agarozu ince bir ped halinde düzleştirmek için hemen üstüne ikinci bir kapak kayması bırakın.
6. 5-10 sn sonra, ikisini birbirinden kaydırarak üst kapak kaymasını çıkarın. Agar pedinin hangi slaytta olduğunu belirleyin ve yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
7. Kırık bir kapak kapağından küçük bir cam parçası seçin ve forseps kullanarak pedin üst kenarına yakın agara hafifçe bastırın (Ek Şekil S1).
8. Agaroz çözeltisi ile mikroenjeksiyon pedleri yapmaya devam edin.
9. Agaroz pedlerini gece boyunca bankta veya fırında kurutun. Coverslip kutusunda saklayın.
   NOT: Agaroz pedleri 2 aya kadar kullanılabilir, ancak yalnızca bir enjeksiyon çalışması için kullanılır.

2. Mikroenjeksiyon için solucanlar elde etmek için Strongyloides'in kültürlenmesi: enjeksiyondan 1 - 2 gün önce

NOT: Ek Materyalde, gerbillerin ve sıçanların nematodlarla nasıl enfekte edileceğine ve enfekte hayvanların dışkılarından nematodların nasıl toplanacağına dair ayrıntılı bir açıklama içeren bir gerinim bakım protokolü bulunabilir.

1. Enjeksiyon gününden iki gün önce, enfekte olmuş hayvanları ^9,10 gece boyunca toplama kafeslerine yerleştirin.
2. Ertesi sabah, istila edilmiş dışkıları toplayın ve dışkı-kömür plakaları ^9,10 yapın.
3. Serbest yaşayan solucanların genç yetişkinlere dönüşmesine izin vermek için 24 saat boyunca 25 ° C'de bir plaka yerleştirin.
4. Enjeksiyon gününden önceki gece, enfekte olmamış konakçı hayvanları toplama kafeslerine yerleştirin.
5. Enjeksiyon gününde, enjeksiyon sonrası ekim için istila edilmemiş dışkı toplayın.

3. Mikroenjeksiyon karışımının yapılması: enjeksiyon gününden önce veya enjeksiyon gününde

NOT: Mikroenjeksiyon karışımı, solucan tamponlu salin (BU) içinde istenen konsantrasyona seyreltilmiş ilgili plazmidlerden oluşur (50 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH₂PO₄, 70 mM NaCl)¹¹.

1. Plazmid stoklarının konsantrasyonunu ve mikroenjeksiyon karışımında istenen konsantrasyonu belirleyin (Tablo 1).

Mikroenjeksiyon karışımı: muhabir yapısı
Parça	Stok Konsantrasyonu	Miktar	Son Konsantrasyon
pMLC30 gpa-3::gfp	300 ng/μL	1,7 μL	50 ng/μL
BU	Na	8,3 μL	Na
toplam		10 μL	50 ng/μL
Mikroenjeksiyon karışımı: CRISPR / Cas9 mutagenezi
Parça	Stok Konsantrasyonu	Miktar	Son Konsantrasyon
pMLC47 vergi-4 sgRNA	300 ng/μL	2,7 μL	80 ng/μL
pEY11 Ss-vergi-4 HDR plazmid	400 ng/μL	2,0 μL	80 ng/μL
pPV540 strCas9 plazmid	350 ng/μL	1,1 μL	40 ng/μL
BU	Na	4,2 μL	Na
toplam		10 μL	200 ng/μL
Mikroenjeksiyon karışımı: piggyBac entegrasyonu
Parça	Stok Konsantrasyonu	Miktar	Son Konsantrasyon
pMLC30 gpa3::gfp	300 ng/μL	2,0 μL	60 ng/μL
pPV402 transpozaz plazmidi	450 ng/μL	0,9 μL	40 ng/μL
BU	Na	7,1 μL	Na
toplam		10 μL	100 ng/μL

Tablo 1: Mikroenjeksiyon karışımlarına örnekler. Üç örnek mikroenjeksiyon karışımı için plazmidler ve konsantrasyonlar: biri gpa-3::GFP muhabiri yapı 10 için, biri Ss-tax-4 lokus 14,15'in CRISPR / Cas9 aracılı bozulması için ve biri de bir Ss-gpa-3::GFP yapısının piggyBac-aracılı entegrasyonu için ^13,17,18. strCas9, Strongyloides kodon için optimize edilmiş Cas9 genini gösterir. Listelenen son konsantrasyonlar Strongyloides mikroenjeksiyon karışımlarında yaygın olarak kullanılır.

2. BU'daki plazmidleri toplam 10-20 μL hacme kadar seyreltin.
3. Karışımı 1-2 dakika boyunca 5.000 × g'lık bir filtre sütunundan döndürün.
4. Mikroenjeksiyon karışımını hemen kullanın veya ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.

4. Mikroenjeksiyon için genç yetişkin Strongyloides toplayın: enjeksiyon gününün sabahı

1. Baermann aparatını 1 adet genç yetişkin Strongyloides fekal-kömür plakası ile kurun (Şekil 2).
   NOT: Fekal-kömür plakası bazı enfektif larvalar içerebilir. Kişisel koruyucu ekipman laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz korumasından oluşur. Eldiven ile laboratuvar önlüğünün kılıfı arasında hiçbir cilt açığa çıkmamalıdır.

Resim 2: Kültürlerden parazitik solucanlar toplamak için kullanılan Baermann aparatı¹⁰. Bir dışkı-kömür plakasının içeriği, bir ılık su sütununun üstüne yerleştirilir. Solucanlar suya göç eder ve huninin dibinde toplanır. (A) Baermann aparatını kurmak için, Baermann hunisinin standı bir C-kelepçesi ile tezgaha kelepçelenir. Huni ucuna tutturulmuş bir lastik tüp kıstırma kelepçeleri ile kapatılır ve damlamalar için tüpün altına bir yakalama kovası yerleştirilir. Cam huniye ılık su eklenir. (B) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucu daha sonra 3 adet laboratuvar dokusu ile kaplanır (solda). Bir dışkı-kömür plakasının içeriğini (sağda) plastik halka tutucuya aktarmak için tahta bir çubuk veya dil depresörü (orta) kullanılır. (C) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucunun tabanının yakın çekimi, tutucunun tabanını kaplayan çift naylon tül tabakasını gösterir. (D) Fekal-kömür tutucu daha sonra cam hunisinin üstüne yerleştirilir. (E) Laboratuvar dokusu su ile nemlendirilir ve fekal-kömür karışımı üzerine kapatılır. Çoğunlukla dışkı-odun kömürünü suya batırmak için daha fazla ılık su eklenir. (F) Baermann'ın komple kurulumu, fekal-kömür kültürü ılık suya batırılmış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Bir O-ring kullanarak bir halka standına kauçuk toplama borulu bir cam huni takın ve bir kelepçe ile sabitleyin. Toplama borusunu 2 tutamlı kelepçelerle kapatın (Şekil 2A).
3. Damlamaları yakalamak için huninin altına bir yakalama kovası yerleştirin.
4. Huniye jantın 5 cm altına kadar ılık (yaklaşık 40 ° C) su ekleyin. Sistemin sızıntı yapmadığını doğrulayın.
5. 2 plastik halkadan yapılmış, aralarında 2 kat naylon tül ağ bulunan ve üst üste binen 3 laboratuvar dokusu parçası bulunan Baermann tutucuyu hizalayın. Fekal-kömür karışımını Baermann tutucuya ekleyin (Şekil 2B,C).
6. Baermann tutucuyu dışkı-kömür karışımı ile huniye yerleştirin. Dokuları fekal-kömür karışımının etrafına katlayın ve fekal-odun kömürünün çoğunu suya batırmak için yeterli su ekleyin. Huni kenarından 2 cm'nin üzerini doldurmayın (Şekil 2D,E).
7. Kokuyu içermesi için huniyi 15 cm'lik plastik Petri kabı kapağı ile doldurun. Huni gerektiği gibi etiketleyin (Şekil 2F).
8. Solucanları Baermann cihazından toplamak için 30 dakika ila 1 saat bekleyin.
9. Huni'nin altındaki kauçuk borunun altında 50 mL'lik bir santrifüj tüpü tutun. 50 mL tüpe solucanlar içeren 30-40 mL su dağıtmak için alttaki kelepçeleri dikkatlice açın.
10. Solucanları içeren Baermann suyunun 15 mL'sini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 15 mL santrifüj tüpünü ~ 750 × g'de (yavaş ) 1 dakika boyunca döndürün. Alternatif olarak, solucanların yerçekiminin 10-15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
11. Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve herhangi bir solucanı öldürmek için süpernatantı iyotlu bir atık sıvı kaba atın.
12. 15 mL toplama tüpüne daha fazla Baermann suyu ekleyin ve spini tekrarlayın. Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve adım 4.11'deki gibi atın.
13. Tüm solucanlar 15 mL santrifüj tüpünde toplanana kadar 4.11 ve 4.12 adımlarını tekrarlayın. Son dönüşten sonra, mümkün olduğunca fazla su çıkarın.
14. Tüpün dibindeki solucan peletini (40-100 μL) inceleyin. Hiçbir solucan görünmüyorsa, 1-2 saat daha bekleyin ve Baermann cihazından daha fazla solucan toplamayı deneyin.
15. Solucanları mümkün olduğunca az su içinde, E. coli HB101 çim ile 6 cm2% NGM plakasına aktarın. Bu plakayı mikroenjeksiyon için kaynak plaka olarak kullanın.
16. Fekal-kömür karışımını, seyreltilmiş iyotla (Lugol'un iyotunun% 50 seyreltilmesi) sulandırarak, damlamaları yakalamak için plastik filme sararak ve biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına yerleştirerek atın.
17. Yakalama kovasına 10 mL seyreltilmiş iyot ekleyin ve fazla suyu Baermann'dan içine boşaltın.
18. Yeniden kullanılabilir bileşenleri (huni, yakalama kovası, tüllü plastik tutucu, plastik kapak ve kelepçeler) % 10 ağartıcı ile yıkayın ve iyice durulayın.

5. Mikroenjeksiyon iğnelerinin çekilmesi ve yüklenmesi: enjeksiyondan hemen önce

1. Bir iğne çektirme makinesi kullanarak cam kılcal tüpleri çekerek mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın.
   NOT: 3 mm platin/iridyum filamenti ile donatılmış ticari bir iğne çektirme makinesi için örnek ayarlar Isı = 810-820, Çekme = 800-820, mikrometre = 2,5'tir.
2. İpuçlarını diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. İğneler istenen şekle sahipse (Şekil 3A-F), 4-6 iğne (2-3 kılcal tüp) çekin. Uygun iğne şeklini elde etmek için, ayarları gerektiği gibi değiştirin: Isı veya Çekme ayarlarını 10 ile ayarlayın ve konik ve şaftın şekli daha uygun olana kadar yeni iğneler çekin.

Şekil 3: Mikroenjeksiyon iğneleri ve mikroenjeksiyon için en uygun bölgelere sahip bir Strongyloides stercoralis yetişkin dişi tanımlanmıştır. (A-F) Mikroenjeksiyon iğnelerinin görüntüleri. (A-B) Mikroenjeksiyon için doğru şekillendirilmiş bir iğnenin şaft konikliği (A) ve ucu (B). Uç, kütikülü delecek kadar keskin ve aşırı hasara neden olmayacak kadar dardır. (C-D) Mikroenjeksiyon için yanlış şekillendirilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesinin şaft konik (C) ve ucu (D). Ucu çok künt ve geniştir ve solucana aşırı zarar verir. (E-F) Mikroenjeksiyon için çalışmak için çok uzun ve ince olması muhtemel bir iğnenin şaft koniği (E) ve ucu (F). F'deki uç, D'deki uca çok benzer. Bununla birlikte, şaft kütikülü etkili bir şekilde delmek için daha dar ve esnektir. Ek olarak, çok ince iğneler kolayca tıkanır. (G) İğnenin sağdan geldiğini varsayarsak, mikroenjeksiyon için doğru şekilde yerleştirilmiş tüm solucanın görüntüsü. Anterior aşağı ve sola; vulva ok ucu ile gösterilir. Gonad dişinin sağ tarafı boyunca görülebilir. Bu dişinin rahminde sadece bir yumurta vardır (yıldız işareti ile gösterilir). (H, I) Mikroenjeksiyon bölgelerinin büyütülmüş görünümleri. Okun açısı, enjeksiyon iğnesinin açısına yaklaşır. Vulva bir dönüm noktası olarak kullanılabilir; gonadın kollarından solucanın karşı tarafındadır. Gonadın kolları bağırsağın etrafında kıvrılır ve bölünen çekirdeklerin uçları vulvanın karşısındadır. (H) Gomadın arka kolu; (I) ön kol. Bunlardan biri veya her iki kol enjekte edilebilir. H, I için, sözleşmeler G'deki gibidir. Ölçek çubukları = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. İğneleri sabitlemek ve uçlarda toz birikmesini önlemek için çekilen iğneleri 15 cm'lik plastik bir Petri kabında bir parça haddelenmiş bantla saklayın.
4. Mikroenjeksiyon karışımının 0,7 μL'lik bir damlasını şaftın açık ucuna yerleştirin. Konik şaftı 10 dakika içinde karışımla doldurmak için haddelenmiş bir bant parçası kullanarak iğneyi rafa dik olarak asın. İlkinin işe yaramaması durumunda bir seferde 2 iğne hazırlayın.

6. Mikroskobun hazırlanması ve iğnenin kırılması

NOT: Mikroenjeksiyon, iğnenin hareketini kontrol etmek için bir mikroenjektör kurulumuyla donatılmış 5x ve 40x hedefleri olan ters çevrilmiş bir mikroskop kullanır. Ters çevrilmiş mikroskop, titreşim gürültüsünü azaltmak için ağır bir masaya veya titreşim önleyici hava tablasına yerleştirilmelidir. Mikroenjektör iğne tutucusu, mikroenjeksiyon karışımını iletmek için gereken basıncı uygulayan azot gazına bağlanır. Solucanları aktarmak için yakındaki daha küçük bir diseksiyon mikroskobu kullanılır.

1. Sıvı akışına bağlı olarak, iğneyi kırmak için gaz tankı basıncını ~ 40-60 psi'ye ve mikroenjeksiyon için ~ 30-50 psi'ye ayarlayın.
2. Diseksiyon mikroskobunda, mikroenjeksiyon pedi kapağı üzerindeki cam parçasını, standart bir platin solucanı toplama kullanarak halokarbon yağı ile örtün.
3. Mikroenjeksiyon pedi kapağını mikroenjeksiyon kapsamına yerleştirin ve yağla kaplı cam parçasını bulun. Cam parçasını, iğneyi kırmak için kullanılan yüzey olarak hizmet etmek için bir kenar iğnenin yönüne dik olacak şekilde hizalayın.
4. Diseksiyon mikroskobunu kullanarak iğnenin konik şaftta kabarcık veya döküntü olmadığını doğrulayın. Ardından, iğneyi basınçlı tutucuya 1-1,5 cm sabitleyin.
5. İğnenin ucunu mikroskop görüş alanının merkezine gözle yerleştirin. Daha sonra düşük büyütme altında, iğnenin ucunu cam parçasının yanına dik olarak görüş alanına yerleştirin.
6. Yüksek güce geçin ve iğnenin ucunu camın kenarıyla, yakınına yakın ancak dokunmadan hizalayın.
   NOT: Çekildiğinde, iğneler kapalı olarak kaynaştırılır.
7. Sıvı akışına izin vermek üzere iğnenin ucunu kırmak için, gazdan sürekli basınç uygularken cam parçasının yan tarafına hafifçe dokunun (Ek Şekil S1). Sıvı akmaya başladığında, ucun şeklini kontrol edin ve kolayca akan sıvı ile keskin olduğundan emin olun.
   NOT: Sıvı çok hızlı akıyorsa veya ucu çok küntse, mikroenjeksiyon sırasında solucanlar zarar görecektir (Video 1 ve Şekil 3A-F).
8. Sıvı iğneden iyi akarken, mikroenjeksiyon kaydırağını diseksiyon kapsamına taşıyın ve solucanların yerleştirilmesi için agar pedine 1-2 μL halokarbon yağı damlaları yerleştirin.
9. Fazla yüzey bakterilerini uzaklaştırmak ve mikroenjeksiyon için tek solucanları seçmek için 20-30 genç yetişkin Strongyloides'i bakterisiz %2'lik bir NGM plakasına en az 5 dakika boyunca aktarın. Enjekte ederken gerektiğinde NGM plakasına daha fazla solucan ekleyin.

7. Mikroenjeksiyon Strongyloides

1. Bakterisiz% 2 NGM plakasından gonadında 1-4 yumurta bulunan bir Strongyloides genç yetişkin dişi seçmek için solucan seçiminde az miktarda halokarbon yağı kullanın.
2. Solucanı agar pedi üzerinde küçük bir yağ damlasına aktarın. Solucan seçimini kullanarak, solucanı yavaşça sarılacak ve gonad görünür ve erişimi kolay olacak şekilde konumlandırın. Gonadın yönüne dikkat edin (Şekil 3G).
3. Solucanı mikroenjeksiyon mikroskobu görüş alanına yerleştirin. Gondanın iğne ile aynı tarafta olduğundan ve iğnenin gonadla hafif bir açıyla temas edecek şekilde konumlandırıldığından emin olun (Şekil 3H, I).
4. İğnenin ucunu aynı odak düzleminde solucanın yanına getirin. Solucanın ortasına yakın gonad kolunu hedefleyin. İğneyi nazikçe gonadın içine sokmak için mikroenjektörü kullanın (Video 2).
5. Tüm gonad kolunu DNA çözeltisi ile nazikçe doldurmak için derhal iğneye basınç uygulayın. Yeterli sıvının ne zaman enjekte edildiğini gözle belirleyin (Video 2).
   NOT: Gonadın doldurulması 2 sn'ye kadar sürebilir.
6. İğneyi çıkarın ve yaranın kapandığını belirlemek için kontrol edin.
   NOT: Gonad vücut duvarından çıkıntı yaparsa solucan soy üretmek için çok hasar görür (Ek Video S1).
7. Görünürse gonadın diğer koluyla tekrarlayın.
8. Enjeksiyon bittiğinde, iğnenin ucuyla agar pedi üzerine basınç uygulayarak iğnenin tıkanmadığını hızlı bir şekilde doğrulayın. Slaytı enjekte edilen solucanla diseksiyon mikroskobuna aktarın.
9. Enjekte edilen solucanı kurtarmak için, önce agar pedinden yüzdürmek için solucanın üzerine birkaç damla BU yerleştirin.
10. Bir solucan yavrusu üzerinde az miktarda HB101 bakterisi toplayın. Solucanı sıvıdan çıkarmak için solucan üzerindeki yapışkan bakterilerle solucana dokunun.
11. Solucanı nazikçe HB101 çim içeren %2'lik bir NGM plakası olan geri kazanım plakasına aktarın.
    NOT: Solucan birkaç dakika içinde emeklemeye başlamalıdır.
12. Birkaç dişi enjekte edildikten sonra, kaynak plakadan enjekte edilmemiş bazı erkekler ekleyin.
    NOT: Beş kadın için en az bir erkek iyi bir temeldir; fazla erkek tercih edilir.
13. Deney için yeterli sayıda kadın enjekte edilene kadar tüm adımları tekrarlayın.
14. Solucanların iyileşmesine ve çiftleşmesine izin vermek için yetişkinleri enjeksiyondan sonra en az 1 saat boyunca kurtarma plakasında bırakın.

8. Enjekte edilen Strongyloides'in geri kazanılması ve kültürlenmesi

1. Enfekte hayvanlarla aynı protokolü kullanarak, enfekte olmamış konakçı hayvanlardan bir gecede dışkı toplayın.
2. İnfüze edilmemiş dışkıyı az miktarda odun kömürü ile karıştırın (bu plakalar için dışkı - kömür oranı yaklaşık 2 ila 1).
3. Az miktarda dışkı-kömür karışımını, nemli filtre kağıdı ile kaplı 6 cm'lik bir Petri kabına dökün. Karışımın tabağın kapağına temas etmediğinden emin olun.
4. 3 μL'de ayarlanmış bir pipet kullanarak, solucanları dışkı-kömür plakasındaki dışkıya aktarın. Solucanları odun kömürüne değil, doğrudan dışkıya yerleştirin.
5. Yetişkinlerin diseksiyon kapsamı kullanarak fekal-kömür plakasında olduğunu doğrulayın.
6. Solucanları kültürlemek için, plakayı nemlendirilmiş bir odaya, yani nemli kağıt havlularla kaplı sıkı oturan bir kapağı olan plastik bir kutuya yerleştirin.
   NOT: 2 gün sonra, larva aşamalarının bir karışımı olacaktır. 5 gün sonra, larvaların çoğu iL3'lere dönüşmüş olacaktır; birkaç genç larva kalacak. 7 gün sonra, tüm larvalar iL3s olmalıdır.

9. Transgenik / nakavtları kurtarmak için F ₁ larvalarının toplanması ve taranması

1. Bir Baermann kurulumu kullanarak, larvaları enjeksiyon sonrası küçük ölçekli dışkı-kömür kültür plakalarından toplayın. Mümkün olduğunca çok larva elde etmek için, solucanları Baermann cihazından kurtarmadan önce en az 2 saat bekleyin.
2. Larvaları 4.10-4.14 adımlarında olduğu gibi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde yoğunlaştırın ve larvaları BU'lu küçük bir saat camına aktarın.
3. Larvalar davranışsal deneyler için kullanılacaksa, tarama için kalın bir HB101 çimi ile% 2 NGM plakaları kullanın.
   1. 20-30 larvayı HB101 çimlerine aktarın.
      NOT: Bakteriler larvaların hareketini yavaşlatacaktır.
   2. Bir floresan diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen transgeni ifade eden larvaları tanımlayın. Transgenik larvaları seçmek için bir solucan seçimi kullanın ve onları BÜ'lü küçük bir saat camına taşıyın.
   3. Başka bir küçük larva grubunu taramak için yeni bir HB101 plakası kullanın. Deneysel kullanım için yeterli larva toplandığında, HB101 plakalarını ve fazla solucanları seyreltilmiş iyotla (suda seyreltilmiş Lugol'un iyotunun% 50'si) tedavi edin ve biyolojik tehlike atıkları olarak atın. Alternatif olarak, alkil benzil amonyum klorürler içeren konsantre köpek kulübesi temizleyici kullanarak fazla solucanları öldürün.
   4. Solucanları hemen kullanın veya bir gecede az miktarda BU içinde sığ bir saat camında bırakın.
      NOT: Sıvı çok derinse solucanlar hipoksik hale gelebilir. Larvaları bir gecede BU'da bırakmanın belirli davranışları etkilemesi mümkündür; Bu nedenle, larvaları 6 saat içinde davranışsal deneyler için kullanın.
4. Larvalar davranışsal tahliller için değil, mikroskopi için kullanılacaksa, solucanları tarama için geri dönüşümlü olarak nikotin felci ile hareketsiz hale getirin.
   1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, solucanların plaka üzerindeki yerini takip etmeyi kolaylaştırmak için 10 cm'lik bir kemotaksis plakası^12'nin plastik tabanına bir ızgara sürün.
   2. BÜ'deki ~ 3 μL larvayı ızgaradaki bir kareye bırakın. Gerektiği kadar kare doldurun. Larvalar plakanın kenarlarına kadar sürünebileceğinden, plakanın kenarlarına yakın olanları kullanmayın.
   3. Solucan damlalarına suya 15-20 μL damla% 1 nikotin ekleyin.
      NOT: 4 dakika sonra solucanlar felç olacaktır.
   4. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak solucanları tarayın.
   5. Transgenik larvaları 1-2 mL BÜ'lü küçük bir saat camına aktarmak için bir solucan seçimi kullanın.
      NOT: Larvalar birkaç saat boyunca felç olur ve mikroskopi için mikroskop slaytlarına kolayca monte edilebilir. BU'da bir gecede bırakılırsa, iL3'ler iyileşir ve bazı tahliller veya memeli konakçı enfeksiyonu için kullanılabilir. Bununla birlikte, nikotin felci ve BÜ'de bir gecede inkübasyon bazı davranışları etkileyebilir.

Sonuçlar

Deney başarılı olursa,_F1 larvaları ilgilenilen transgen ve / veya mutant fenotipini ifade edecektir (Şekil 4). Bununla birlikte, dönüşüm oranları oldukça değişkendir ve yapılara, solucanların sağlığına, enjeksiyon sonrası kültürleme koşullarına ve deneycinin becerisine bağlıdır. Genel olarak, başarılı bir deney, enjekte edilen dişi başına >15 F₁ larva ve floresan belirteçler için% >3'lük bir dönüşüm oranı verecektir. Toplam canl?...

Tartışmalar

Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenez ve CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez için yapıları S. stercoralis ve S. ratti'ye tanıtma yöntemlerini detaylandırır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti için, enjeksiyon sonrası sağkalım ve transgenez veya mutajenez oranı, ince ayar yapılabilen çeşitli değişkenlere tabidir.

Başarılı transgenez için ilk kritik düşünce, plazmid transgenlerinin nasıl oluşturulduğudur. Önceki çalışmalar, St...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope