Geração de Transgênicos e Nocautes em Espécies Strongyloides por Microinjeção

Resumo

O kit de ferramentas genômicas funcionais para os nematoides parasitéticos Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti inclui transgênese, mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 e RNAi. Este protocolo demonstrará como usar a microinjeção intragonadal para introduzir componentes transgenes e CRISPR em S. stercoralis e S. ratti.

Resumo

O gênero Strongyloides consiste em várias espécies de nematoides penetrantes na pele com diferentes faixas hospedeiras, incluindo Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti. S. stercoralis é um nematode parasitário humano-parasitico e penetrante na pele que infecta aproximadamente 610 milhões de pessoas, enquanto o parasita de rato S. ratti está intimamente relacionado com S. stercoralis e é frequentemente usado como modelo de laboratório para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis quanto S. ratti são facilmente favoráveis à geração de transgênicos e nocautes através da técnica de entrega de ácido nucleico exógeno da microinjeção intragonadal, e como tal, surgiram como sistemas de modelo para outros helmintos parasitas que ainda não são favoráveis a esta técnica.

Os adultos parasitéticos Strongyloides habitam o intestino delgado de seu hospedeiro e liberam descendentes no ambiente através das fezes. Uma vez no ambiente, as larvas se desenvolvem em adultos livres, que vivem em fezes e produzem descendentes que devem encontrar e invadir um novo hospedeiro. Esta geração ambiental é única para as espécies Strongyloides e semelhante o suficiente em morfologia ao modelo nematode de vida livre Caenorhabditis elegans que técnicas desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com esses nematoides parasitas, incluindo microinjeção intragonadal. Usando microinjeção intragonadal, uma grande variedade de transgenes pode ser introduzida em Strongyloides. Os componentes CRISPR/Cas9 também podem ser microinjetados para criar larvas mutantes strongyloides . Aqui, descreve-se a técnica de microinjeção intragonadal em Strongyloides, incluindo a preparação de adultos livres, o procedimento de injeção e a seleção de progêneria transgênica. Imagens de larvas transgênicas strongyloides criadas usando mutagênese CRISPR/Cas9 estão incluídas. O objetivo deste artigo é permitir que outros pesquisadores usem a microinjeção para criar strongyloides transgênicos e mutantes.

Introdução

Strongyloides stercoralis tem sido negligenciado por muito tempo como um importante patógeno humano comparado com as minhocas mais reconhecidas e a lombriga Ascaris lumbricoides¹. Estudos anteriores de carga de vermes muitas vezes subestimaram severamente a prevalência de S. stercoralis devido à baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos comuns para S. stercoralis². Nos últimos anos, estudos epidemiológicos baseados em ferramentas de diagnóstico aprimoradas estimaram que a verdadeira prevalência de infecções por S. stercoralis é muito maior do que o relatado anteriormente, aproximadamente 610 milhões de pessoas em todo o mundo².

Tanto S. stercoralis quanto outras espécies strongyloides, incluindo o parasita de rato intimamente relacionado e o modelo de laboratório comum S. ratti, têm um ciclo de vida incomum que é vantajoso para estudos genômicos experimentais porque consiste tanto das gerações parasitárias quanto de vida livre (ambiental)³ (Figura 1). Especificamente, tanto S. stercoralis quanto S. ratti podem percorrer uma única geração de vida livre. A geração de vida livre consiste em larvas pós-parasitárias que se desenvolvem em machos e fêmeas adultos vivos livres; toda a descendência dos adultos livres se desenvolve em larvas infecciosas, que devem infectar um hospedeiro para continuar o ciclo de vida. Além disso, essa geração ambiental ou de vida livre pode ser manipulada experimentalmente em laboratório. Como adultos strongyloides de vida livre e adultos C. elegans compartilham morfologia semelhante, técnicas como microinjeção intragonadal que foram originalmente desenvolvidas para C. elegans podem ser adaptadas para uso com strongyloides^adultos de vida livre ^4,5. Enquanto o DNA é geralmente introduzido em fêmeas adultas de vida livre, tanto machos quanto fêmeas de Strongyloides podem ser microinjetados⁶. Assim, ferramentas genômicas funcionais estão disponíveis para interrogar muitos aspectos da biologia de Strongyloides. Outros nematoides parasitas não possuem uma geração livre e, como resultado, não são tão facilmente favoráveis às técnicas genômicas funcionais³.

Figura 1: O ciclo de vida Strongyloides stercoralis. As fêmeas parasitárias S. stercoralis habitam o intestino delgado de seus hospedeiros mamíferos (humanos, primatas não humanos, cães). As fêmeas parasitas se reproduzem por partenogênese e colocam ovos dentro do intestino delgado. Os ovos eclodem enquanto ainda estão dentro do hospedeiro em larvas pós-parasitárias, que são então passadas para o ambiente com fezes. Se as larvas pós-parasitárias são machos, elas se desenvolvem em machos adultos vivos livres. Se as larvas pós-parasitárias forem fêmeas, elas podem se desenvolver em fêmeas adultas de vida livre (desenvolvimento indireto) ou larvas infecciosas de terceiro estágio (iL3s; desenvolvimento direto). Os machos e fêmeas que vivem livremente se reproduzem sexualmente para criar descendentes que são constrangidos a se tornarem iL3s. Sob certas condições, S. stercoralis também pode sofrer autoinfecção, na qual algumas das larvas pós-parasitárias permanecem dentro do intestino hospedeiro em vez de passar para o ambiente em fezes. Essas larvas podem evoluir para larvas autoinfetivas (L3a) dentro do hospedeiro, penetrar através da parede intestinal, migrar através do corpo e, eventualmente, retornar ao intestino para se tornarem adultos reprodutivos. O ciclo de vida de S. ratti é semelhante, exceto que S. ratti infecta ratos e não tem um ciclo autoinfetivo. A geração ambiental é fundamental para o uso de espécies Strongyloides para estudos genéticos. As fêmeas adultas de vida livre (P₀) podem ser microinjetadas; sua descendência, que todos se tornarão iL3s, são os transgênicos F₁ potenciais. Este valor foi modificado de Castelletto et al. ³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

S. stercoralis compartilha muitos aspectos de sua biologia com outros nematoides gastrointestinais humanos-parasitas, incluindo invasão de hospedeiro e modulação imunológica hospedeira. Por exemplo, as minhocas parasitárias humanas nos gêneros Necator e Ancylostoma também infectam pela penetração da pele, navegam de forma semelhante através do corpo e, em última análise, residem como adultos parasitas no intestino delgado⁷. Assim, muitos nematoides gastrointestinais provavelmente usam comportamentos sensoriais comuns e técnicas de evasão imunológica. Como resultado, o conhecimento obtido de Strongyloides complementará os achados em outros nematoides menos geneticamente tratáveis e levará a uma compreensão mais completa desses parasitas complexos e importantes.

Este protocolo de microinjeção descreve o método para introduzir DNA em fêmeas adultas de vida livre strongyloides para fazer prole transgênico e mutante. Os requisitos de manutenção da cepa, incluindo o tempo de desenvolvimento de vermes adultos para microinjeções e a coleta de progêneria transgênica, são descritos. Protocolos e uma demonstração da técnica completa de microinjeção, juntamente com protocolos para cultivo e triagem de progêneria transgênica, estão incluídos, juntamente com uma lista de todos os equipamentos e consumíveis necessários.

Protocolo

NOTA: Gerbils foram usados para passagem de S. stercoralis, e ratos foram usados para passagem de S. ratti. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Escritório de Supervisão de Pesquisa Animal da UCLA (Protocolo nº 2011-060-21A), que adere às normas AAALAC e ao Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. As seguintes tarefas devem ser concluídas pelo menos um dia antes da microinjeção: cultivo de vermes, preparação de almofadas de microinjeção, criação de construções para a mistura de microinjeção e disseminação de bactérias (E. coli HB101)^{em placas} de 6 cm Nematode Growth Media (NGM). As fêmeas livres requerem uma coleta mínima de 24h pós-fecal a 25 °C para se desenvolverem em adultos jovens antes de serem microinjetadas. As almofadas de microinjeção devem estar completamente secas. As placas bacterianas devem secar e estabelecer um pequeno gramado.

1. Preparação de slides de microinjeção: pelo menos um dia antes de injetar

NOTA: Os vermes são montados em tampas de microinjeção com almofadas de ágar seco para injeção.

1. Coloque um bloco de calor a 90 °C.
2. Adicione 5 mL de ddH₂O, depois 100 mg de agarose a um tubo de vidro borossilicato.
3. Aqueça a mistura de agarose no tubo sobre uma chama até que a agarose seja dissolvida.
4. Coloque o tubo em um bloco de calor definido a 90 °C para manter a agarose no estado líquido.
5. Solte ~180 μL da solução agarose em um deslizamento de tampa usando uma tubulação pasteur de vidro ou uma tubulação com uma ponta de plástico. Imediatamente solte uma segunda mancha de cobertura em cima para achatar a agarose em uma almofada fina.
6. Depois de 5-10 s, remova a tampa superior deslizando os dois para fora. Determine em que slide a almofada de ágar está e coloque-a de frente para cima.
7. Selecione um pequeno pedaço de fragmento de vidro de uma mancha de cobertura quebrada e pressione-o suavemente no ágar perto da borda superior da almofada usando fórceps (Figura Suplementar S1).
8. Continue fazendo almofadas de microinjeção com a solução agarose.
9. Seque as almofadas de agarose durante a noite no banco ou em um forno. Guarde na caixa de deslizamento.
   NOTA: As almofadas de agarose podem ser usadas por até 2 meses, mas são usadas apenas para uma corrida de injeção.

2. Culturing Strongyloides para obter vermes para microinjeção: 1 - 2 dias antes da injeção

NOTA: Um protocolo de manutenção de cepas pode ser encontrado no Material Suplementar, que inclui uma descrição detalhada de como infectar gerbils e ratos com nematoides e colher nematoides das fezes de animais infectados.

1. Dois dias antes do dia da injeção, coloque os animais infectados ^9,10 em gaiolas de coleta durante a noite.
2. Na manhã seguinte, recolher fezes infestadas e fazer placas fecais-carvão ^9,10.
3. Coloque uma placa a 25 °C por 24 h para permitir que os vermes livres se desenvolvam em adultos jovens.
4. Na noite anterior ao dia da injeção, coloque animais hospedeiros não infectados em gaiolas de coleta.
5. No dia da injeção, colete fezes não infestadas para cultivo pós-injeção.

3. Fazer a mistura de microinjeção: antes ou no dia da injeção

NOTA: A mistura de microinjeção consiste nos plasmídeos de interesse diluídos à concentração desejada em soro fisiológico tamponado por verme (BU) (50 mM Na₂HPO₄, 22 mM KH₂PO₄, 70 mM NaCl)¹¹.

1. Determine a concentração dos estoques plasmídeos e a concentração desejada na mistura de microinjeção (Tabela 1).

Mistura de microinjeção: construção de repórter
Componente	Concentração de Estoque	Quantidade	Concentração Final
pMLC30 gpa-3:::gfp	300 ng/μL	1,7 μL	50 ng/μL
Bu	na	8,3 μL	na
total		10 μL	50 ng/μL
Mistura de microinjeção: MUTAGÊNESE CRISPR/Cas9
Componente	Concentração de Estoque	Quantidade	Concentração Final
pMLC47 imposto-4 sgRNA	300 ng/μL	2,7 μL	80 ng/μL
pEY11 Ss-tax-4 HDR plasmid	400 ng/μL	2,0 μL	80 ng/μL
pPV540 strCas9 plasmid	350 ng/μL	1,1 μL	40 ng/μL
Bu	na	4,2 μL	na
total		10 μL	200 ng/μL
Mistura de microinjeção: integração cofrinhoBac
Componente	Concentração de Estoque	Quantidade	Concentração Final
pMLC30 gpa3::gfp	300 ng/μL	2,0 μL	60 ng/μL
pPV402 transposase plasmid	450 ng/μL	0,9 μL	40 ng/μL
Bu	na	7,1 μL	na
total		10 μL	100 ng/μL

Tabela 1: Exemplos de misturas de microinjeção. Os plasmídeos e concentrações para três misturas de microinjeção de exemplo: uma para um gpa-3::GFP repórter construção¹⁰, uma para crispr/cas9-mediada interrupção do lócus Ss-tax-4 ^14,15, e uma para a integração mediada por PiggyBac de um Ss-gpa-3::GFP construto 13,17,18. strCas9 denota o gene Cas9 otimizado para codon strongyloides. As concentrações finais listadas são comumente usadas em misturas de microinjeção Strongyloides.

2. Diluir os plasmídeos em BU para um volume total de 10-20 μL.
3. Gire a mistura através de uma coluna de filtro a 5.000 × g por 1-2 min.
4. Use a mistura de microinjeção imediatamente ou armazene-a a -20 °C para uso futuro.

4. Colete strongyloides para microinjeção: manhã do dia da injeção

1. Configure o aparelho Baermann com 1 placa fecal-carvão de strongyloides jovens adultos (Figura 2).
   NOTA: A placa fecal-carvão pode conter algumas larvas infecciosas. O equipamento de proteção individual consiste em um jaleco, luvas e proteção ocular. Nenhuma pele deve ser exposta entre a luva e a manga do jaleco.

Figura 2: O aparelho Baermann costumava coletar vermes parasitas das culturas¹⁰. O conteúdo de uma placa fecal-carvão é colocado no topo de uma coluna de água morna. Os vermes migram para a água e coletam no fundo do funil. (A) Para configurar o aparelho Baermann, a posição do funil Baermann é presa ao banco com um grampo C. Um tubo de borracha preso à extremidade do funil é fechado com grampos de beliscão, e um balde de captura é colocado sob o tubo para gotejamentos. Água morna é adicionada ao funil de vidro. (B) O suporte do anel plástico para a mistura fecal-carvão é então forrado com 3 pedaços de tecidos de laboratório (esquerda). Uma vara de madeira ou depressor de língua (meio) é usado para transferir o conteúdo de uma placa fecal-carvão (à direita) para o suporte do anel de plástico. (C) Um close-up da parte inferior do suporte do anel plástico para a mistura fecal-carvão, mostrando a camada dupla de tule de nylon forrando a parte inferior do suporte. (D) O suporte de carvão fecal é então colocado na parte superior do funil de vidro. (E) O tecido de laboratório é umedecido com água e fechado sobre a mistura fecal-carvão. Mais água morna é adicionada para submergir principalmente o carvão fecal. (F) A configuração completa de Baermann, com a cultura fecal-carvão submerso sob água morna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Instale um funil de vidro com tubos de coleta de borracha em um suporte de anel usando um anel O e fixe-o com um grampo. Feche a tubulação de coleta com 2 grampos de pinça (Figura 2A).
3. Coloque um balde debaixo do funil para pegar gotas.
4. Adicione água quente (aproximadamente 40 °C) ao funil a 5 cm abaixo da borda. Verifique se o sistema não está vazando.
5. Fora o suporte Baermann, uma peneira feita de 2 anéis plásticos com 2 camadas de rede de tule de nylon presas entre eles, com 3 pedaços sobrepostos de tecido de laboratório. Adicione a mistura fecal-carvão ao suporte Baermann (Figura 2B,C).
6. Coloque o suporte Baermann com a mistura fecal-carvão no funil. Dobre os tecidos ao redor da mistura fecal-carvão e adicione água suficiente para submergir a maior parte do carvão fecal. Não encha acima de 2 cm da borda do funil (Figura 2D,E).
7. Cubra o funil com uma tampa de placa de Petri de plástico de 15 cm para conter o odor. Rotule o funil conforme necessário (Figura 2F).
8. Espere 30 min a 1 h para recolher os vermes do aparelho Baermann.
9. Segure um tubo de centrífugas de 50 mL sob a tubulação de borracha na parte inferior do funil. Abra cuidadosamente os grampos na parte inferior para distribuir 30-40 mL de água contendo vermes no tubo de 50 mL.
10. Transfira 15 mL da água Baermann contendo os vermes para um tubo de centrífuga de 15 mL. Gire o tubo de centrífuga de 15 mL por 1 min a ~750 × g (lento). Alternativamente, permitir que os vermes se contentem com 10-15 min.
11. Remova o supernatante para ~2 mL e descarte o supernatante em um recipiente líquido de resíduos com iodo para matar qualquer verme.
12. Adicione mais água Baermann ao tubo de coleta de 15 mL e repita o giro. Remova o supernatante para ~2 mL e descarte como na etapa 4.11.
13. Repita as etapas 4.11 e 4.12 até que todos os vermes sejam coletados no tubo centrífuga de 15 mL. Após o giro final, remova o máximo de água possível.
14. Inspecione a pelota de vermes (40-100 μL) na parte inferior do tubo. Se nenhum verme for visível, espere por mais 1-2 h e tente coletar mais vermes do aparelho Baermann.
15. Transfira os vermes em tão pouca água quanto possível para uma placa de 6 cm 2% de NGM com um gramado de E. coli HB101. Use esta placa como a placa de origem para a microinjeção.
16. Descarte a mistura fecal-carvão tratando-a com iodo diluído (uma diluição de 50% do iodo de Lugol na água), embrulhando-o em filme plástico para pegar gotas, e colocando-o em um recipiente de resíduos de risco biológico.
17. Adicione 10 mL de iodo diluído ao balde de captura e escorra o excesso de água do Baermann nele.
18. Lave os componentes reutilizáveis (o funil, o balde de captura, o suporte plástico com tule, a tampa plástica e os grampos) com 10% de alvejante e enxágue bem.

5. Puxar e carregar agulhas de microinjeção: pouco antes da injeção

1. Prepare agulhas de microinjeção puxando tubos capilares de vidro usando um puxador de agulha.
   NOTA: As configurações de exemplo para um puxador de agulha comercial equipado com um filamento de platina/irídio de 3 mm são Calor = 810-820, Pull = 800-820, micrômetro = 2,5.
2. Veja as dicas em um microscópio de dissecação. Se as agulhas tiverem a forma desejada (Figura 3A-F), puxe agulhas 4-6 (2-3 tubos capilares). Para alcançar a forma adequada da agulha, altere as configurações conforme necessário: ajuste as configurações de Calor ou Puxão por 10 e puxe novas agulhas até que a forma do afunilador e do eixo sejam mais apropriadas.

Figura 3: Agulhas de microinjeção e uma fêmea adulta Strongyloides stercoralis com locais ideais para microinjeção identificadas. (A-F) Imagens de agulhas de microinjeção. (A-B) O eixo (A) e a ponta (B) de uma agulha que é corretamente moldada para microinjeção. A ponta é afiada o suficiente para perfurar a cutícula e estreita o suficiente para não causar danos excessivos. (C-D) O afunilador do eixo (C) e a ponta (D) de uma agulha de microinjeção que é incorretamente moldada para microinjeção. A ponta é muito contundente e larga, e causará danos excessivos ao verme. (E-F) O eixo (E) e a ponta (F) de uma agulha que provavelmente será muito longa e esbelta para trabalhar para microinjeção. A dica em F é muito semelhante à ponta em D. No entanto, o eixo é mais estreito e flexível demais para perfurar efetivamente a cutícula. Além disso, agulhas muito esbeltas entupem facilmente. (G) Uma imagem de todo o verme corretamente posicionada para microinjeção, assumindo que a agulha está vindo da direita. Anterior é para baixo e para a esquerda; a vulva é indicada pela ponta da flecha. A gônda é visível ao longo do lado direito da fêmea. Esta fêmea tem apenas um óvulo no útero (indicado pelo asterisco). (H, I) Vistas ampliadas dos locais de microinjeção. O ângulo da seta aproxima o ângulo da agulha de injeção. A vulva pode ser usada como um marco; está no lado oposto do verme dos braços da gônus. Os braços da gônnad curva ao redor do intestino, e as extremidades com os núcleos divisórias são opostos à vulva. (H) O braço posterior da gônada; (I) o braço anterior. Ou ambos os braços podem ser injetados. Para H, eu, convenções são como em G. Barras de escala = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Guarde as agulhas puxadas em uma placa de Petri de plástico de 15 cm com um pedaço de fita laminada para fixar as agulhas e para evitar o acúmulo de poeira nas pontas.
4. Coloque uma gota de 0,7 μL da mistura de microinjeção na extremidade aberta do eixo. Pendure a agulha perpendicular a uma prateleira usando um pedaço de fita laminado para encher o eixo afilado com a mistura dentro de 10 minutos. Prepare 2 agulhas de cada vez caso a primeira não funcione.

6. Preparar o microscópio e quebrar a agulha

NOTA: A microinjeção utiliza um microscópio invertido com objetivos de 5x e 40x equipados com uma configuração de microinjetor para controlar o movimento da agulha. O microscópio invertido deve ser colocado sobre uma mesa pesada ou mesa de ar anti-vibração para reduzir o ruído vibracional. O suporte de agulha microinjetor está conectado ao gás nitrogênio que aplica a pressão necessária para entregar a mistura de microinjeção. Um microscópio de dissecação menor nas proximidades é usado para transferir os vermes.

1. Coloque a pressão do tanque de gás em ~40-60 psi para quebrar a agulha e ~30-50 psi para microinjeção, dependendo do fluxo líquido.
2. No microscópio de dissecação, cubra o fragmento de vidro na tampa da almofada de microinjeção com óleo de halocarboneto usando uma picareta de verme de platina padrão.
3. Coloque a tampa da almofada de microinjeção no escopo da microinjeção e localize o fragmento de vidro coberto de óleo. Alinhe o fragmento de vidro de tal forma que uma borda seja perpendicular à direção da agulha para servir como a superfície usada para quebrar a agulha.
4. Verifique se a agulha não tem bolhas ou detritos no eixo afilado usando o microscópio de dissecação. Em seguida, fixar a agulha de 1-1,5 cm no suporte pressurizado.
5. Posicione a ponta da agulha no centro do campo de microscópio de visão a olho. Em seguida, sob baixa ampliação, posicione a ponta da agulha no campo de visão, perpendicular ao lado do fragmento de vidro.
6. Mude para alta potência e alinhe a ponta da agulha com a borda do vidro, perto, mas não tocá-la.
   NOTA: Quando puxadas, as agulhas são fundidas fechadas.
7. Para quebrar a ponta da agulha para permitir o fluxo líquido, bata-a suavemente na lateral do pedaço de vidro enquanto aplica pressão contínua do gás (Figura Suplementar S1). Uma vez que o líquido comece a fluir, verifique a forma da ponta e certifique-se de que ela está afiada com líquido fluindo facilmente.
   NOTA: Se o líquido estiver fluindo muito rápido ou a extremidade estiver muito brusca, os vermes serão danificados durante a microinjeção (Vídeo 1 e Figura 3A-F).
8. Quando o líquido estiver fluindo bem da agulha, mova o slide de microinjeção para o escopo de dissecação e coloque gotas de óleo de halocarbono de 1-2 μL na almofada de ágar para colocação dos vermes.
9. Transfira 20-30 strongyloides jovens adultos para uma placa de 2% de NGM sem bactérias por pelo menos 5 minutos para remover bactérias superficiais em excesso e selecionar vermes únicos para microinjeção. Adicione mais worms à placa NGM conforme necessário durante a injeção.

7. Microinjeção strongyloides

1. Use uma pequena quantidade de óleo de halocarbono em uma picareta de vermes para selecionar uma fêmea adulta jovem Strongyloides com 1-4 ovos em sua gônnad da placa de 2% NGM sem bactérias.
2. Transfira o verme para uma pequena gota de óleo no ágar pad. Usando a picareta de verme, posicione suavemente o worm para que ele não seja enrolado e a gônada seja visível e de fácil acesso. Observe a direção da gôngeo (Figura 3G).
3. Posicione o verme no campo de visão do microscópio de microinjeção. Certifique-se de que a gônada está do mesmo lado da agulha e posicionada para que a agulha entre em contato com a gônada em um leve ângulo (Figura 3H,I).
4. Leve a ponta da agulha para o lado do verme no mesmo plano focal. Mire no braço de gônada perto do meio do verme. Use o microinjetor para inserir a agulha suavemente na gônada (Vídeo 2).
5. Aplique imediatamente pressão na agulha para encher suavemente todo o braço da gônada com a solução de DNA. Determine pelo olho quando o fluido suficiente foi injetado (Vídeo 2).
   NOTA: Pode levar até 2 s para encher a gônus.
6. Remova a agulha e verifique se a ferida se fecha.
   NOTA: O verme está muito danificado para produzir prole se a gôndula se projetar através da parede do corpo (Vídeo Suplementar S1).
7. Repita com o outro braço da gônada se estiver visível.
8. Quando terminar a injeção, verifique rapidamente se a agulha não está entupida aplicando pressão com a ponta da agulha no ágar pad. Transfira o slide com o verme injetado para o microscópio de dissecação.
9. Para recuperar o verme injetado, primeiro lugar algumas gotas de BU no verme para flutuar-lo fora do ágar pad.
10. Colete uma pequena quantidade de bactérias HB101 em uma picareta de vermes. Toque no verme com as bactérias aderentes na picareta de vermes para removê-lo do líquido.
11. Transfira suavemente o worm para a placa de recuperação , uma placa de 2% de NGM contendo um gramado HB101.
    NOTA: O verme deve começar a rastejar em poucos minutos.
12. Depois que algumas fêmeas foram injetadas, adicione alguns machos não injetados da placa de origem.
    NOTA: O mínimo de um macho para cinco fêmeas é uma boa linha de base; um excesso de machos é preferido.
13. Repita todos os passos até que fêmeas suficientes tenham sido injetadas para o experimento.
14. Deixe os adultos na placa de recuperação por pelo menos 1h após a injeção para permitir que os vermes se recuperem e acasalem.

8. Recuperação e cultivo de Strongyloides injetados

1. Coletar fezes durante a noite de animais hospedeiros não infectados, usando o mesmo protocolo que para animais infectados.
2. Misture as fezes não infestadas com uma pequena quantidade de carvão (fezes à relação carvão de aproximadamente 2 a 1 para essas placas).
3. Despeje uma pequena quantidade da mistura fecal-carvão em uma placa de Petri de 6 cm forrada com papel filtro úmido. Certifique-se de que a mistura não toque na tampa do prato.
4. Diluir a placa de recuperação com BU. Utilizando um conjunto de tubulação a 3 μL, transfira os vermes para as fezes na placa fecal-carvão. Coloque os vermes diretamente nas fezes, não no carvão.
5. Verifique se os adultos estão na placa fecal-carvão usando um escopo de dissecação.
6. Para cultivar os vermes, coloque a placa em uma câmara umidificada, ou seja, uma caixa de plástico com uma tampa apertada forrada com toalhas de papel úmidas.
   NOTA: Após 2 dias, haverá uma mistura de estágios larvais. Após 5 dias, a maioria das larvas terá se desenvolvido em iL3s; algumas larvas mais jovens permanecerão. Depois de 7 dias, todas as larvas devem ser iL3s.

9. Coleta e triagem de larvas F ₁ para recuperar transgênicos/nocautes

1. Usando uma configuração Baermann, colete as larvas das placas de cultivo de carvão fecal de pequena escala pós-injeção. Para obter o máximo de larvas possível, espere pelo menos 2 h antes de recuperar os vermes do aparelho Baermann.
2. Concentre as larvas em um tubo de centrífuga de 15 mL como nos passos 4.10-4.14 e transfira as larvas para um pequeno vidro de relógio com BU.
3. Se as larvas serão usadas para experimentos comportamentais, use placas de NGM de 2% com um gramado grosso de HB101 para triagem.
   1. Transfira 20-30 larvas para o gramado HB101.
      NOTA: A bactéria vai retardar o movimento das larvas.
   2. Sob um microscópio de dissecação de fluorescência, identifique as larvas expressando o transgene de interesse. Use uma picareta de vermes para selecionar as larvas transgênicas e movê-las para um pequeno vidro de relógio com BU.
   3. Use uma nova placa HB101 para testar outro pequeno lote de larvas. Quando forem coletadas larvas suficientes para uso experimental, trate as placas hb101 e o excesso de vermes com iodo diluído (50% de iodo lugol diluído em água) e descarte-os como resíduos de risco biológico. Alternativamente, mate o excesso de vermes usando limpador de canil concentrado contendo cloretos de amônio benzilo.
   4. Use os worms imediatamente ou deixe-os em um vidro de relógio raso em uma pequena quantidade de BU durante a noite.
      NOTA: Os vermes podem ficar hipóxicos se o líquido for muito profundo. É possível que deixar larvas na BU durante a noite pode afetar certos comportamentos; portanto, use larvas para experimentos comportamentais dentro de 6 h.
4. Se as larvas serão usadas para microscopia e não ensaios comportamentais, então imobilize os vermes por paralisia de nicotina reversivelmente para triagem.
   1. Usando uma lâmina de barbear, marque uma grade no fundo plástico de uma placa de 10 cm de quimioterapia¹² para facilitar o controle da localização dos vermes na placa.
   2. Solte ~3 μL de larvas em BU em um quadrado na grade. Encha quantos quadrados necessários. Não utilize os próximos às bordas da placa, pois as larvas podem rastejar para os lados da placa.
   3. Adicione 15-20 gotas de μL de 1% de nicotina na água às gotas de verme.
      NOTA: Depois de 4 minutos, os vermes ficarão paralisados.
   4. Tela os vermes usando um microscópio dissecando fluorescência.
   5. Use uma picareta de vermes para transferir as larvas transgênicas para um pequeno vidro de relógio com 1-2 mL de BU.
      NOTA: As larvas ficarão paralisadas por várias horas e podem ser facilmente montadas em lâminas de microscópio para microscopia. Se deixado durante a noite em BU, os iL3s se recuperarão e podem ser usados para alguns ensaios ou infecção por hospedeiro mamífero. No entanto, a paralisia da nicotina e a incubação noturna na BU podem afetar certos comportamentos.

Resultados

Se o experimento foi bem sucedido, as larvas F₁ expressarão o fenótipo de interesse transgênico e/ou mutante (Figura 4). No entanto, as taxas de transformação são altamente variáveis e dependem dos construtos, da saúde dos vermes, das condições de cultivo pós-injeção e da habilidade do experimentador. Em geral, um experimento bem sucedido produzirá > 15 larvas F₁ por fêmea injetada e uma taxa de transformação de >3% para marcadores fluorescentes. Se o n...

Discussão

Este protocolo de microinjeção detalha os métodos para a introdução de construções para transgênese e mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 em S. stercoralis e S. ratti. Tanto para S. stercoralis quanto para S. ratti, a sobrevida pós-injeção e a taxa de transgênese ou mutagênese estão sujeitas a várias variáveis que podem ser ajustadas.

A primeira consideração crítica para a transgênese bem sucedida é como transgenes plasmídeos são cons...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope